Інформація

Топологія ДНК. Питання про скручування і корчування

Топологія ДНК. Питання про скручування і корчування


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Привіт, хлопці, є питання, яке зводить мене з розуму відтоді, як я побачив це відео (https://youtu.be/az2c6UbEdug). О 4:50 хлопець каже, що коли правостороння циркулярна ДНК починає утворювати переплетення правої руки, ДНК має відрегулюватися, скручуючи більше (Ви бачите, що число збільшується до 8 з 5 в рівнянні) і що при переплетенні корч робиться в зворотному напрямку, він повинен менше крутитися. Для мене це взагалі не має сенсу. Я думав, що коли ви перекручуєте вправо, скручування повинно зменшуватися, а коли ви перекручуєте вліво, скручування має збільшуватися. Чи може хтось пояснити (або показати дуже чітку діаграму/ілюстрацію, яка пояснює це), будь ласка??


Все це пояснюється тут, у Вікіпедії. Якщо ви хочете створити власну 3D-модель, ви можете використовувати два шматки тигонової трубки (наприклад, гумовий шланг для пальника Бунзена), які мають циркулярну форму та прикріплені за допомогою роз’ємів, які можна відкривати та закривати, що дозволяє вам імітувати висічення і повторне ущільнення пасом.


Математика показує, як ДНК скручується, обертається і розстібається

Маріель Васкес отримує фінансування від Національного наукового фонду (CAREER DMS 1519375, DMS 1716987 і DMS 1817156).

Партнери

Каліфорнійський університет надає фінансування як партнер-засновник The Conversation US.

The Conversation UK отримує фінансування від цих організацій

Якщо ви коли-небудь бачили зображення молекули ДНК, ви, напевно, бачили її у її знаменитій B-формі: дві нитки, які згортаються один навколо одного праворуч, утворюючи подвійну спіраль. Але чи знали ви, що ДНК може змінювати свою форму?

Молекули ДНК, які несуть генетичний код організму, повинні бути щільно упаковані, щоб поміститися всередину клітини. Однак кожні кілька годин клітина виробляє вірну копію свого геному, готуючись до поділу клітини. Цей процес реплікації створює величезний стрес на ДНК і може змінити її форму смертельно.

Як математик і біолог, мене цікавить, як математика може описати різноманітні форми ДНК, а також клітинні процеси, такі як реплікація ДНК. Відповіді на ці питання надихають на нову математику і, можливо, краще зрозуміти молекулу життя.


Робота Старостіна 2002 року була опублікована в 2005 році (Старостін 2005), але препринтова версія містить більше матеріалу, ніж її опублікована версія, і, зокрема, цілий розділ, присвячений адитивності корчування, на який ми посилаємось у нашій роботі.

Порівняйте з рівнянням 16 у Старостін (2005). До речі, ми вказуємо на помилку в круглому члені цієї формули, яку слід переписати як (+round(aL/2pi )) .

Зауважимо, що така ж точка зору (F) була введена Криком (1976).

Той факт, що в скелетній структурі вектор дотичної представляє розривні точки, може виявитися обмеженням для застосування теореми, але цю проблему можна легко вирішити шляхом визначення правильної процедури обмеження (Старостін 2005).


Математика показує, як ДНК скручується, обертається і розстібається

Вузол ДНК, який видно під електронним мікроскопом. Хав'єр Арсуага, CC BY-ND

Якщо ви коли-небудь бачили зображення молекули ДНК, то, напевно, бачили її у її знаменитій B-формі: дві нитки, які згортаються один навколо одного праворуч, утворюючи подвійну спіраль. Але чи знали ви, що ДНК може змінювати свою форму?

Молекули ДНК, які несуть генетичний код організму, повинні бути щільно упаковані, щоб поміститися всередину клітини. Однак кожні кілька годин клітина виробляє вірну копію свого геному, готуючись до поділу клітини. Цей процес реплікації створює величезний стрес на ДНК і може змінити її форму смертельно.

Як математик і біолог, мене цікавить, як математика може описати різноманітні форми ДНК, а також клітинні процеси, такі як реплікація ДНК. Відповіді на ці питання надихають на нову математику і, можливо, краще зрозуміти молекулу життя.

Щоб зрозуміти математику форми ДНК, потрібно розглянути як її геометрію, так і її топологію. Це споріднені, але різні поняття.

Геометрія описує об’єкт у певний момент часу – застиглий у просторі, як скульптура. У клітині спіраль ДНК накручується на себе, або «суперспіраль». Спосіб згортання і згортання ДНК кодує цінну геометричну інформацію, яка може мати вирішальне значення для контролю способу експресії генів.

Ці три об’єкти мають дуже різну геометрію, але топологічно однакові – це означає, що об’єкти можна згинати або скручувати з однієї форми в іншу. Авторство зображення: Маріель Васкес, CC BY

Топологія описує, як об’єкт плавно деформується, ніби зроблений з глини, не роблячи нових отворів чи розривів. Наприклад, уявіть собі гумку, яка крутиться у вирі. Коли вода закручується, гумка скручується, розтягується і стискається. Усі форми, які приймає смуга під час її руху, топологічно ідентичні, але геометрично різні.

Просте копіювання ДНК створює велику кількість проблем, пов’язаних з формою, але зображення з підручників рідко ілюструють цю топологічну загадку.

Під час клітинного циклу кожна хромосома реплікується у дві ідентичні копії. Для того, щоб це сталося, спіраль ДНК повинна розкрутитися, викликаючи стрес на ДНК. ДНК реагує на цей стрес суперзгортанням, як старий телефонний шнур. Але клітина не витримує занадто сильного суперзгортання. Якщо ДНК спотвориться занадто сильно, клітина постраждає.

Молекула ДНК може бути лінійною – як у випадку людських хромосом – або круговою. Приклади кільцевих молекул ДНК включають бактеріальні хромосоми та мітохондріальну ДНК людини. Якщо молекула ДНК циркулярна, то клітинні процеси, такі як реплікація, можуть зв’язувати ДНК у вузли або ланки, як кільця в брелоку. Вузли та зв’язки ДНК можуть спричинити порушення роботи клітин або навіть загинути.

Ескіз подвійної спіралі ДНК правої руки (ліворуч). Розкриття спіралі, позначене трикутником, призводить до скручування ДНК (праворуч). Суперкотушка виникає, коли вісь спіралі, позначена фіолетовим кольором, накручується на себе. Авторство зображення: Маріель Васкес, CC BY

Розглянемо бактерію кишкова паличка. Його генетичний код знаходиться в одній ДНК-хромосомі. в кишкова паличка та інших бактерій, подвійна спіраль ДНК замикається в коло, як скручена гумка.

Тиражування кишкова паличка хромосома може статися в пробірці всього за 20 хвилин. Але коли циркулярна хромосома реплікується, процес дає дві пов’язані між собою хромосоми. Тобто нові хромосоми утворюють два кільця, зчеплених між собою. Нові хромосоми повинні від’єднатися, перш ніж клітина поділиться на дві клітини. Інакше вони або зламалися б на шляху до своєї клітини-мішені, або одна клітина успадкувала б дві взаємозв’язані копії однієї хромосоми, а в іншій взагалі не було б цієї хромосоми.

Клітина набирає ферменти, щоб роз’єднати ДНК. Ферменти, які називаються топоізомеразами і рекомбіназами, діють як ножиці і клей для ДНК. Вони можуть змінювати геометрію та топологію ДНК, підтримуючи таким чином стабільний геном. в кишкова паличка, топоізомерази невтомно працюють під час і після реплікації, щоб підтримувати здоровий рівень суперзгортання та безпечно роз’єднувати хромосоми.

Реплікація кільцевої молекули ДНК. Стрілки показують напрямок реплікації (ліворуч). Нові молекули взаємозв’язуються в цьому процесі (праворуч). Авторство зображення: Маріель Васкес, CC BY

Коли топоізомерази не діють

Коли топоізомерази не діють, клітина в кінцевому підсумку гине. Це робить їх хорошими мішенями для розробки ліків. Але клітини мають різні типи топоізомераз та інших ферментів, таких як рекомбінази, які можуть прийти на допомогу. Наприклад, ми показали, що в кишкова паличка клітини, де топоізомерази, відповідальні за роз’єднання, були відключені, інші ферменти, які називаються сайт-специфічними рекомбіназами, можуть роз’єднати реплікаційні зв’язки.

І топоізомерази, і сайт-специфічні рекомбінази зв’язують дволанцюгову ДНК і можуть змінювати її форму, вводячи розриви. Топоізомерази типу II вводять розрив уздовж молекули ДНК і транспортують інший шматочок ДНК через розрив перед повторним закріпленням. Сайт-специфічні рекомбінази приєднуються до двох сайтів уздовж ДНК, вводять по одному розрізу в кожну, потім знову з’єднують кінці.

Моя лабораторія використовує математику та комп’ютерне моделювання, щоб зрозуміти, як ці ферменти роз’єднують молекули ДНК. Хоча місцева дія добре зрозуміла на біохімічному рівні, як саме ферменти спрощують топологію ДНК, досі залишається загадкою.

В одному з наших досліджень ми зосередилися на кишкова паличка клітини, де топоізомерази не працюють. Ми показали, як розв’язати посилання реплікації за мінімальну кількість кроків.

Загалом, шляхів, що роз’єднуються, може бути багато. Ми використовуємо комп’ютерне моделювання, щоб призначити ймовірності кожному шляху. Наша робота показує, що у випадку реплікаційних зв’язків найпростіший шлях — це той, який, швидше за все, проходять ферменти.

Складні математичні методи можуть допомогти пояснити, як ферменти роз’єднують ДНК. Без математичного моделювання дослідники були б обмежені спрощеними моделями, запропонованими біологічними експериментами.

Ця стаття була спочатку опублікована на The Conversation. Прочитайте оригінальну статтю.


Скрутіть, щоб розплутати

Переплетення молекул ДНК часто призводить до утворення «надтонких містків» між сестринськими хроматидами, які необхідно розв’язати під час сегрегації хроматид на дочірні клітини. Хоча було встановлено, що ці мости ДНК покриті геліказою PICH, залишається невідомим, яким чином PICH сприяє їх розділенню. Тепер дослідження показує, що PICH спрямовує утворення позитивної суперспіралі ДНК у присутності топоізомераз типу I, щоб сприяти подальшому розплутування цих спіралей ДНК топоізомераз типу II. Примітно, що PICH міг би змінити топологію ДНК, видавлюючи петлі ДНК, коли вона рухається вздовж подвійної спіралі.

Через свою довгу, спіральну природу, сестринські молекули ДНК виходять із механізму реплікації сильно заплутаними 1 . Ці переплетення ДНК, як правило, розв’язуються топоізомеразами типу II, які є ферментами, які тимчасово створюють дволанцюговий розрив в одній спіралі ДНК, щоб забезпечити проходження другої спіралі ДНК через проміжок у першій. Неможливість розплутати основну частину катенації ДНК до початку поділу клітини — наприклад, в результаті інгібування топоізомерази — призводить до виникнення так званих «анафазних містків»: ДНК, яка розтягується між сегрегуючими сестринськими хроматидами. Однак навіть у клітинах без порушень взаємозв’язки між сестринськими хроматидами зберігаються принаймні короткий час до анафази. Повідомляється, що такі «ультратонкі містки» (UFB) складаються з ДНК без нуклеосом, покритої кількома різними білками, включаючи гелікази PICH (Plk1-interacting checkpoint helicase) 2 і BLM (Bloom helicase) 3 та багатосубодиничний комплекс TRR складається з топоізомерази IIIα типу IA (Top3A), Rmi1 і Rmi2 4 .


Стабілізація ДНК

Розглянемо бактерію кишкова паличка. Його генетичний код знаходиться в одній ДНК-хромосомі. в кишкова паличка та інших бактерій, подвійна спіраль ДНК замикається в коло, як скручена гумка.

Тиражування кишкова паличка хромосома може статися в пробірці всього за 20 хвилин. Але коли циркулярна хромосома реплікується, процес дає дві пов’язані між собою хромосоми. Тобто нові хромосоми утворюють два кільця, зчеплених між собою. Нові хромосоми повинні від’єднатися, перш ніж клітина поділиться на дві клітини. Інакше вони або зламалися б на шляху до своєї клітини-мішені, або одна клітина успадкувала б дві взаємозв’язані копії однієї хромосоми, а в іншій взагалі не було б цієї хромосоми.

Клітина набирає ферменти, щоб роз’єднати ДНК. Ферменти, які називаються топоізомеразами і рекомбіназами, діють як ножиці і клей для ДНК. Вони можуть змінювати геометрію та топологію ДНК, підтримуючи таким чином стабільний геном. в кишкова паличка, топоізомерази невтомно працюють під час і після реплікації, щоб підтримувати здоровий рівень суперзгортання та безпечно роз’єднувати хромосоми.

Реплікація кільцевої молекули ДНК. Стрілки показують напрямок реплікації (ліворуч). Нові молекули взаємозв’язуються в цьому процесі (праворуч). - Авторство зображення: Маріель Васкес, CC BY


2. Фон

Кілька визначень, подвійна спіраль і хроматин

Для початку ми повинні представити деякі слова та поняття, які ми будемо використовувати знову і знову в подальшому. Це мета цього першого розділу, тому його можна використовувати як глосарій, до якого можна повернутися, коли буде потрібно.

ДНК — це генетичний матеріал, який міститься всередині всіх живих організмів: вона містить всю інформацію, щоб зробити нас тим, ким ми є. ДНК являє собою дуже довгий дволанцюговий полімер, де кожен ланцюг містить послідовність нуклеотидів. У нуклеотиді є три компоненти: цукор, фосфат і основа. Хоча цукор і фосфат однакові для кожного нуклеотиду, в алфавіті ДНК є чотири можливі основи: цитозин (C), гуанін (G), аденін (A) і тимін (T). Два ланцюга в молекулі пов’язані водневими зв’язками між основами: вони утворюються між C і G або між A і T. Таким чином, два ланцюга «комплементарні»: якщо ви знаєте послідовність одного ланцюга, ви можете з’ясувати послідовність іншого, оскільки основами будуть ті, які утворюють водневі зв'язки з основами в першому ланцюзі. Кожна пара основ — по одній у кожній нитці — називається «базовою парою», яку часто позначають «bp». Відстані вздовж молекул ДНК вимірюються шляхом підрахунку, скільки пар основ ми повинні пройти, щоб перейти від однієї точки до іншої: типовими відстанями, які ми будемо використовувати, є пари кілобази або мегапари основ (кбп або Мбіт/с відповідно).

Тепер час трохи геометрії! ДНК являє собою вузький полімер товщиною близько 2 нм, схожий на ширину пари основ. Фізіологічна форма ДНК в нашому тілі називається «В-ДНК», символічна подвійна правостороння спіраль, вперше відкрита Уотсоном, Кріком і Франкліном (рис.а)). Історія свідчить, що Розалінд Франклін виділила два типи волокон ДНК з природних джерел: B-ДНК, коли вона зберігала волокна вологими, і A-ДНК, коли вона зберігала їх сухими (рис. 1(б)). Джеймс Вотсон і Френсіс Крік інтерпретували B-форму, простішу з двох, у своїй знаковій статті про структуру ДНК 1953 року.

Фігура 1. Структури ДНК. (а) Структурне представлення B-ДНК (ліворуч) та A-ДНК (праворуч). (б) Просте представлення пар основ у вигляді паралелепіпедів і фосфатів у вигляді кулі. Оскільки відстань між сусідніми фосфатами фіксована, вони не можуть точно укладатися один на одного. Щоб приховати якомога більше поверхні гідрофобних основ, основи можуть розташовуватися перекошено (ліворуч) або гвинтоподібним (праворуч): у 3D найбільш вигідною конфігурацією є остання, і це є причиною того, чому ДНК являє собою подвійну спіраль. Відтворено з Calladine C R, Drew H R, Luisi B F та Travers A A 2004 Розуміння ДНК: молекула і як вона працює (Лондон: Elsevier/Academic Press).

Чому ДНК утворює подвійну спіраль, чудово проілюстровано в книзі Розуміння ДНК Кріса Калладіна та Горація Дрю (пізніші видання також у співавторстві Бен Луїзі та Ендрю Треверс). Ключова проблема полягає в тому, що, хоча фосфат і цукри розчиняються у воді, основи ні (трохи як жир). Наші клітини і ядра переповнені водою, тому пари основ намагаються поховати якомога більшу частину своєї поверхні в областях, недоступних для молекул води. Корисною геометричною моделлю для пари основ є цеглинка шириною 2 нм (діаметр ДНК), глибиною близько 1 нм і висотою 0,34 нм. Фосфати можна вважати маленькими кульками збоку кожної цеглини (рис. 1(б)), розділені на 0,6 нм. Оскільки фосфати прив’язані, змінити цю відстань неможливо. В результаті неможливо покласти основи один на одного, щоб заховати їхню найширшу грань, оскільки фосфати розсунуть основи, пропускаючи воду. Одним з можливих рішень є перекошена конструкція сходів (рис. 1(б) ліворуч), однак природа віддає перевагу гвинтовій структурі на правій панелі на малюнку 1, оскільки це призводить до трохи більшого захисту жирових основ від води.

Тепер потрібні ще кілька чисел і визначень. Хоча дволанцюгова ДНК є генетичним матеріалом більшості живих організмів, вона буває різних розмірів і форм. У прокаріотів, таких як бактерії, ДНК існує у вигляді замкнутого циклу в кілька Мбіт. Еукаріоти обмежують свою ДНК всередині ядра, яке розділене рештою клітини (цитоплазмою) ядерною мембраною. Еукаріотичні організми варіюються від пекарських дріжджів до черв’яків, мух і комах, аж до ссавців, таких як ми. Зазвичай в ядрах еукаріотів є кілька ланцюгів ДНК. Наприклад, більшість людських клітин диплоїдні, тобто вони містять 23 пари хромосом (по одній у кожній парі від матері, одна від батька). Кожна хромосома являє собою лінійну частину ДНК, яка зазвичай набагато довша, ніж у бактерій. У людини хромосоми зазвичай становлять близько 100 Мбіт.

У еукаріотів ДНК завжди пов’язана з білками, які називаються гістонами (більшість із них є октамерами, тобто комплексами восьми білків), щоб утворити «хроматинове волокно», з якого складаються наші хромосоми. Основною одиницею хроматину є частинка ядра нуклеосоми (рис.а)). Частинка ядра нуклеосоми зазвичай складається з 146 пар основ подвійної спіралі ДНК, щільно обгорнутої навколо гістонового октамера трохи менше ніж на два оберти. Сама обгортка є гвинтоподібною: що цікаво, ця спіраль є лівосторонньою (за дуже невеликими винятками), на відміну від правосторонньої спіралі самої ДНК. Взаємодія між октамерами гістонів і ДНК відбувається за рахунок простої електростатики, оскільки октамери гістонів мають високий позитивний заряд, тоді як ДНК заряджена негативно через наявність фосфатів. Не зовсім зрозуміло, чому ДНК існує у вигляді хроматину в еукаріотах, але не в бактеріях, оскільки еволюційна перевага на перший погляд неясна. Однією з можливих причин є те, що щільно загорнута ДНК може легше вписуватися в ядро ​​(хоча необхідно кілька інших шарів ущільнення, див. розділ «Основи організації ДНК» та розділ 3). Крім того, обгортка, ймовірно, механічно захищає ДНК, але також робить наші гени набагато менш активними, ніж, скажімо, гени бактерій, що може бути корисним для більш складних організмів, дозволяючи точніший контроль над експресією генів.

Малюнок 2. Хроматин. (а) Кристальна структура нуклеосоми, що показує ДНК та білки гістонів. Колірне кодування білків: H2A, оранжевий H2B, червоний H3, синій і H4, зелений. Дві копії кожного з гістонів H2A, H2B, H3 і H4 самостійно збираються в гістоновий октамер. (б) Хроматинове волокно складається з багатьох нуклеосом, кожна з яких має ліву обгортку ДНК. Існує багато можливих структур для хроматинового волокна, та, яка зображена тут, відповідає відкритому хроматину, імовірно, відповідає активному хроматину: його також називають волокном 10 нм, оскільки його товщина збігається з товщиною гістонового октамера. Вважається, що неактивні ділянки хроматину згортаються в більш компактні структури. Відтворено з Calladine C R, Drew H R, Luisi B F та Travers A A 2004 Розуміння ДНК: молекула і як вона працює (Лондон: Elsevier/Academic Press).

Послідовні частинки ядра нуклеосоми з’єднані невеликими ділянками, які називаються лінкерною ДНК, розмір яких варіюється (можливе розташування результуючого хроматинового волокна показано на малюнку 2 (б)). У ссавців лінкерна ДНК зазвичай має близько 50 пар основ, тоді як у дріжджів вона набагато коротша (близько 20 пар основ або навіть трохи менше). Дещо дивно, хоча частинки ядра нуклеосом щільніше упаковані, геном дріжджів більш активний, ніж у ссавців. У всіх випадках ДНК лінкера досить мала, щоб виглядати жорсткою (її довжина менша за довжину персистенції, про яку ми докладніше обговоримо нижче). Фізика хроматину обговорюється у чудовій оглядовій статті Гельмута Шисселя в Фізичний журнал: Конденсована речовина, який рекомендується для читачів, які бажають дізнатися більше на цю тему.

Нарешті, ще кілька фактів про те, як інформація, що зберігається в ДНК, отримується клітинним механізмом, допоможуть нам у подальшому. По-перше, «центральна догма» біології стверджує, що ДНК створює РНК, а РНК — білки, молекулярні машини, які виконують більшість роботи, необхідної всередині клітини. Перший процес відомий як транскрипція, на якому ми зосередимося в цій книзі, а другий називається перекладом. Транскрипція ДНК здійснюється за допомогою молекулярного двигуна, який називається РНК-полімеразою. РНК-полімераза зазвичай транскрибує близько 100 bp s -1 у бактерій, тоді як у людини нуклеосоми створюють бар'єр для її просування, а швидкість становить близько 25 bp s -1 або близько 1 kbp s -1 . Не всі гени в молекулах ДНК увімкнені: структура активних генів змінюється від клітини до клітини (око, печінка і білі кров’яні клітини мають дуже різні набори активних генів), а з часом (коли ми захворіємо на грип). , для боротьби із запаленням вмикається певний набір генів). Схема активації гена залежить від складної взаємодії між положенням гена, білками-помічниками (так звані факторами транскрипції) і молекулярними мітками на ДНК і гістонах, які знаходяться «поверх» генетичного коду та полегшують або перешкоджають транскрипції. Другий процес, якого ми торкнемося, це реплікація ДНК. Перед тим, як клітина поділиться, її ДНК має бути реплікована (так що безпосередньо перед мітозом у ядрі було 92 хромосоми). Реплікація виконується за допомогою іншої полімерази, відомої як ДНК-полімераза — вона трохи швидше, ніж її родич РНК, і рухається зі швидкістю до 5 кб/хв -1 у ссавців (1000 біт/с -1 у бактерій).

Номер зв'язку

Оскільки ДНК являє собою подвійну спіраль, ми можемо запитати, який її «шаг» (висота одного повного оберту). У В-ДНК це приблизно 10,5 пар основ, або 3,6 нм. Число зв’язування є ще одним важливим фактором для опису тривимірної структури молекули ДНК, яку ми описуємо в цьому розділі. Ми скористаємося цією концепцією в розділі 3, коли будемо обговорювати фізику суперзгортання ДНК.

Число зв’язку визначається для будь-яких двох кривих, закритих або фіксованих на кінці: воно вимірює кількість разів, коли дві криві обертаються одна навколо одної. Ми також можемо визначити число зв’язку для стрічки, враховуючи намотування двох її країв: у цьому випадку ця величина просто дорівнює кількості разів, коли ми перекручуємо стрічку. Якщо ми закриємо стрічку, нам потрібно зробити цілу кількість поворотів на 360 градусів, щоб верхній край на одному кінці стрічки збігався з верхнім краєм на іншому кінці (відео 1).

Відео 1. У цьому відео показано простий експеримент, що демонструє концепцію зв’язування числа за допомогою паперової стрічки, клею та ножиць. Доступно за адресою http://iopscience.iop.org/book/978-0-7503-1602-6.

Важливою особливістю зв’язного числа закритої стрічки, наприклад гумової стрічки, є те, що вона залишається незмінною з часом, тоді як це не вірно для лінійної стрічки (наприклад, для обгортання подарунків). Чому? По-перше, розглянемо відкриту стрічку. Якщо підкрутити кінці, ви зможете чітко змінити його зв’язковий номер за бажанням. Однак, наприклад, коли ви склеюєте кінці паперової стрічки, коли ви склеюєте два кінці, число зв’язку затримується, і змінити його неможливо.

Оскільки два ланцюга молекули ДНК у її розслабленому стані утримуються близькими й рівновіддаленими завдяки з’єднанню основ через водневий зв’язок, ми можемо представити їх двома краями стрічки заданої ширини, і ми будемо використовувати цю аналогію таким чином. ДНК-подібна стрічка сильно скручена. Оскільки подвійна спіраль B-ДНК робить повний оберт кожні 10,5 пари основ (див. вище), число зв’язування петлі B-ДНК (званої плазмідою) з 1050 пар основ дорівнює 100, тоді як число зв’язування типової людини хромосом близько 10 мільйонів!

Дві замкнуті криві з числом зв'язку п пов’язані за адресою п точки. Переконатися в цьому можна за допомогою простого, але акуратного експерименту (відео 1). Спочатку візьміть дві стрічки, розфарбувавши їх з одного боку, щоб було добре видно скручування. Потім візьміть два кінці першої стрічки і склейте їх разом, не вводячи жодного скручування. Після цього візьміть другу стрічку, а тепер скрутіть її на 360 градусів перед приклеюванням кінців, стежте за тим, щоб кольорові грані збігалися один з одним. Тепер візьміть ножиці і розріжте обидві стрічки посередині, уздовж їх довгих осей. Розкручена стрічка легко розщеплюється, щоб отримати дві нез’єднані менші стрічки. Випадок скрученої стрічки не такий тривіальний: дві отримані половини з’єднуються в одній точці, утворюючи те, що в математиці відоме як зв’язок Хопфа (відео 1). До речі, якщо вам сподобався цей експеримент, ви можете спробувати подивитись, що станеться, якщо стрічка закрутиться наполовину чи півтора: результати досить цікаві!

У цьому простому експерименті, якщо ми думаємо про стрічку як про молекулу ДНК, ножиці представляють білок гелікази, який розрізає два ланцюга ДНК під час реплікації. З’єднання не корисне для щойно реплікованих молекул: вони відчайдушно прагнуть розійтися своїми шляхами, щоб створити дві різні клітини. Дійсно, якщо зв’язок не розірвати швидко, клітина помре (точніше, покінчить життя самогубством, що називається «апоптозом») замість того, щоб успішно реплікуватися. Ця топологічна небезпека, що ховається за реплікацією ДНК, є причиною того, що клітини містять величезну кількість «топологічних ферментів», відомих під загальною назвою топоізомерази. Топоізомераза типу II — це молекулярна машина, здатна розрізати, а потім знову з’єднати дволанцюгову ДНК, щоб розв’язати вузол або зв’язок. ДНК більшості бактерій являє собою одну гігантську петлю, тому наш модельний експеримент безпосередньо моделює те, що з нею відбувається під час реплікації. Тому топоізомераза типу II повинна діяти на кожну з них

400 000 точок зв'язку, створених у кожному раунді реплікації кишкова паличка помилка, яка зустрічається приблизно раз на 30 хвилин у швидко зростаючих бактерій в лабораторії. Хоча людські хромосоми є лінійними, вони також не захищені від пастки зчеплення. Дійсно, більшість еукаріотичних хромосом містять велику кількість геномних петель, які утримуються разом ДНК-зв’язуючими білками (докладніше про це в розділі 3), і ці петлі часто присутні під час реплікації, що призводить до заплутування, якщо топоізомераза II неактивна.

Досить примітно, що зв’язуюча пастка використовується багатьма протипухлинними препаратами, які засновані на різних молекулярних шляхах для пригнічення дії топоізомераз. Ідея полягає в тому, що ракові клітини діляться швидше за інші, тому вони частіше стикаються з проблемою зв’язування. Оскільки інгібування топоізомерази призводить до зв’язування та загибелі клітин, ці препарати за статистикою з більшою ймовірністю вбивають ракові клітини, які з більшою ймовірністю діляться в будь-який момент. Це також є причиною того, що стандартні протипухлинні препарати мають такі неприємні побічні ефекти, як випадання волосся: вони націлені на всі клітини, що швидко діляться, тому клітини волосся знищуються, а також ракові клітини.

Основи організації геному

Щоб зрозуміти, наскільки складною є проблема організації геному в клітині, ми можемо почати з простої оцінки «задня оболонка». Всього в людському геномі диплоїдного ядра міститься близько 6 мільярдів пар основ. Ми знаємо, що пара основ у B-ДНК має розмір приблизно 0,34 нм, тому, якби ми розтягнули всю ДНК всередині однієї клітини нашого тіла, вона мала б приблизно 2 м в довжину, але вона повинна поміститися в межах ядро розміром лише близько 10 мкм. Щоб зрозуміти всю масштабність проблеми, спробуйте обчислити всю кількість ДНК у метрах, яку містить кожне наше тіло. Це справді астрономічна сума: її було б достатньо, щоб досягти Плутона із Землі! Причина, чому така неймовірна кількість ДНК може зберігатися в клітинах або організмах, полягає в тому, що вона така тонка. Незважаючи на це, значна частина нашої маси — це ДНК, і упаковка всього цього — дуже нетривіальна проблема для фізики полімерів.

Щоб обговорити, як живі організми вирішують цю проблему, почнемо з найпростіших форм життя. Бактеріофаги, або фаги, — це віруси, які атакують і вбивають бактерії, тому вони в принципі корисні для таких еукаріотів, як ми, і можуть навіть стати життєздатною, хоча на дотик страшною, альтернативою антибіотикам, якщо вони закінчаться в майбутньому. (на відміну від ліків, ці віруси еволюціонують разом з бактеріями, тому можуть продовжувати їх вбивати, коли вони мутують). Фаги, по суті, являють собою сфери (капсид), наповнені полімерною дволанцюговою ДНК, майже кристалічної щільності. Організація геному не стає простішою, але, проте, знадобилося багато часу, щоб визначити структуру ДНК всередині капсиду!

Одне з питань, що робить проблему нетривіальною, — це конкуренція між шкалами. Один із них — розмір капсиду, який для більшості фагів становить приблизно 50–100 нм. Іншим є довжина персистенції ДНК, яка є довжиною, на якій ДНК вигинається внаслідок теплових коливань. Довжина стійкості також становить близько 50 нм, тому коливання значні в цьому масштабі, що трохи заплутує ситуацію. Нинішній консенсус полягає в тому, що електростатична і стерична взаємодія ДНК-ДНК є ключовими гравцями в цих щільностях і призводять до розташування ДНК у вигляді котушки, трохи нагадує якір моряка, акуратно зібраний. Якщо вас цікавить фізика фагів, Чарльз Ноблер і Білл Гелбарт написали популярну статтю з фізики в Фізика сьогодні у 2008 році, який варто прочитати.

Розуміння основ розташування ДНК у бактеріофагах є корисним, особливо тому, що воно показує, що прості фізичні моделі та ідеї полімерів дуже корисні в цій галузі. Однак організація геному у бактерій та еукаріотів набагато складніша! Це пов’язано з тим, що фізичні параметри відрізняються, а також тому, що з такими геномами пов’язані білки, що впливають на їх фізику. Ми обговоримо важливість білків для організації геному у еукаріотів у розділі 3. Тут ми розглянемо деякі основні фізичні особливості організації полімерів, які варто мати на увазі.

У такій бактерії, як кишкова паличка, існує близько 4 мільйонів пар основ (які були б приблизно 1 мм, якщо їх розтягнути), що містяться в клітині розміром приблизно 1–2 мікрона. Простий розрахунок показує, що щільність набагато нижча, ніж у фага, оскільки сама ДНК становить лише близько 1% від загального об’єму клітини. ДНК бактерій також відрізняється від ДНК фагів тим, що вона постійно злегка розкручується деякими білками клопа — в результаті ДНК «суперскручується». Деякі наслідки цього ми побачимо в розділі 3.

У людини (або інших еукаріотів) ДНК існує у вигляді хроматину. Об’єм, який займають наші хромосоми, становить приблизно 10–20 % об’єму ядра, де вони утримуються. Хоча проблема організації геному є дуже складною, ми знаємо деякі речі про морфологію хромосом завдяки мікроскопії (насправді, ці факти були відомі задовго до Уотсона і Крика!). По-перше, хромосоми конденсуються і стають окремо видимими під мікроскопом під час мітозу — коли клітина ділиться — утворюючи добре відомі Х-подібні циліндричні структури, показані в підручниках з біології. Коли клітина не ділиться (під час «інтерфази»), хромосоми деконденсуються і набагато більше схожі на набряклі полімери.

Ми також знаємо, що під час інтерфази хромосоми утворюють «території». By 'painting' each of them a different colour, we can see that each chromosome occupies its own volume, and there is little intermingling between different chromosomes. The physical basis of territory formation was studied by Angelo Rosa and Ralf Everaers a few years back. They modelled human chromosomes as a melt of polymers interacting only via volume exclusion. Under such assumptions, after the mitotic cylinders decondense at the onset of interphase, if we could wait long enough all chromosomes would intermingle (because this is the equilibrium state of a melt of linear polymers). However, due to sheer size, the dynamics of human chromosomes are so sluggish that they remain separate forever in practice, as calculations suggest that the intermingling time is several decades! Rosa and Everaers' simulations also suggest that within simpler eukaryotes such as yeast, the intermingling is much quicker, and territories should not be observed there, in good agreement with experimental observations.


The biochemical steps by which bacterial topoisomerases alter the topology of DNA are well known. However, it has been a more vexing task to establish physiological roles and sites of action of the different topoisomerases within the context of the bacterial cell cycle. This difficulty can be attributed in part to the redundancy among the activities of the different enzymes. In this microreview, we will focus on recent progress in understanding the topological structure of the chromosome, analysis of topoisomerase mechanism in single-molecule assays and recent data on the regulation and integration of topoisomerase activity within the cell cycle that have all brought a new perspective to the action of topoisomerases in the bacterial cell.

Topological linkage between the two strands of DNA molecules such as the closed circular chromosome of кишкова паличка is described by the linking number, Lk, a quantitative measure of the number of times the two parental strands are wound about each other. In a simple sense, this winding takes two forms: the windings of each strand about the other in the DNA helix, which are often referred to as duplex turns and the windings of the helix about itself in superhelical turns. Again, in the simplest sense, Lk is the sum of the number of duplex turns and superhelical turns with a sign convention thrown in to account for the fact that Lk cannot be changed in a closed DNA ring unless at least one of the strands is broken and resealed. Superhelicity is a powerful thermodynamic driving force for many reactions that occur on the chromosome. This is because the preferred thermodynamic state of a closed circular DNA molecule is the relaxed one, in which there are no supercoils. Thus, reactions that demand unwinding of the parental template strands, such as the transition from a closed to open complex between RNA polymerase and a promoter or DNA replication, are favoured in negatively supercoiled molecules, whereas reactions that demand rewinding of the template strands, such as regression of nascent DNA at a stalled replication fork, are favoured in positively supercoiled molecules. Because Lk cannot change in a closed ring, any alteration of local DNA topology is absorbed by a compensating alteration in a distal part of the molecule. Therein lie the problems solved by topoisomerases.

There are three major tasks for topoisomerases in the bacterial cell: removal of excess positive windings of the chromosome generated as a result of DNA replication maintenance of topological homeostasis of the chromosome and reduction of the topological linkage between sister chromosomes to exactly zero during chromosome partition and cytokinesis. Replication of the кишкова паличка chromosome is bidirectional, and each replication fork proceeds at a speed of 700–1000 nucleotides s −1 . Removal of each duplex turn as the parental template is unwound generates a compensatory positive overwinding that can take one of two forms: a positive supercoil that forms in the unreplicated region of the chromosome ahead of the fork or a precatenane, a positive winding of the two partially replicated sister strands about each other behind the fork. This latter topological form was first suggested by Champoux and Been (1980 ) who noted that, unless the replisomes themselves formed a topological barrier, the positive windings should be able to equilibrate both in front of and behind the replication forks. If not removed at the completion of replication, precatenanes convert to catenanes, i.e. linkages between the two sister chromosomes. DNA replication in кишкова паличка generates somewhere in the region of 200 excess positive linkages s −1 that have to be removed by the topoisomerases.

As if this were not enough of a topological problem, topological homeostasis is beset by the fact that transcription also roils the landscape. As pointed out in the twin-domain supercoiling model of Liu and Wang (1987 ), movement of RNA polymerase through a DNA template creates a screw-like action. If the DNA is constrained from rotating, positive supercoils will accumulate ahead of the transcribing RNA polymerase and negative supercoils will accumulate behind. Thus, to maintain an appropriate global superhelical density on the chromosome, these excess supercoils have to be removed.

Finally, even one residual topological linkage between sister chromosomes at the point of chromosome partition and cytokinesis during the cell cycle is catastrophic, resulting in chromosome breakage and the generation of anucleate cells. In addition, all these topological issues are complicated by the fact that the chromosome itself is organized into topological domains with barriers that impede the free diffusion of supercoils. Any complete description of topoisomerase function in the cell must therefore take into account the likelihood that spatial and temporal control of topoisomerase action is essential.

Can we now provide a complete assessment of topoisomerase action for even one of these tasks? Напевно, ні. We have learned many new things about topoisomerase action in the cell over the last few years, but some of the new data provoke a reconsideration of previous thinking. Of the four topoisomerases present in кишкова паличка, biochemical analysis в пробірці has demonstrated that topoisomerase (Topo) I, Topo III and Topo IV share the ability to relax negative supercoils [(–)sc]. Topo IV and DNA gyrase can relax positive supercoils [(+)sc]. Furthermore, Topo III, Topo IV and gyrase can decatenate and unknot circular DNA molecules ( Champoux, 2001 ). The original idea was that gyrase is primarily responsible for the relaxation of (+)sc. Although standard biochemical measurements made in solution that average the action of all topoisomerase molecules on all substrate molecules demonstrated that the gyrase- and Topo IV-catalysed rates of (+)sc removal were comparable (≈ 0.2–0.3 strand passage events min −1 ), the gyrase-catalysed reaction was processive, whereas the Topo IV-catalysed reaction was distributive ( Hiasa and Marians, 1994 ). Moreover, the unique ability of gyrase directly to convert positive supercoils to negative ones ( Brown and Cozzarelli, 1979 ) strongly implicated gyrase as the primary agent in removing positive supercoils to achieve topological homeostasis. Similarly, the large difference in decatenation activity observed for Topo IV (five strand passage events min −1 ) compared with gyrase (0.07 events min −1 ) ( Hiasa and Marians, 1996 ) suggested a unique role for Topo IV in the removal of precatenanes and catenanes. This assignment was supported by the demonstration в природних умовах that Topo IV alone removed catenanes between plasmid DNA rings and knots within a DNA ring generated by the action of a site-specific resolvase ( Zechiedrich та ін., 1997 Deibler та ін., 2001 ) and that the rate of decatenation of plasmid DNA molecules when gyrase alone was active was roughly 1/100th of that when both gyrase and Topo IV were active ( Zechiedrich and Cozzarelli, 1995 ). This picture has now been muddied.

Khodursky та ін. (2000 ) measured the rate of replication fork progression in synchronized cells in which either gyrase alone or both gyrase and Topo IV were inactivated by treatment with different concentrations of novobiocin. Passage of the replication fork was scored by the increase in the dosage of any particular gene as measured by hybridization of the DNA to microarrays consisting of polymerase chain reaction (PCR) products representing 96% of the кишкова паличка open reading frames (ORFs). By taking samples over time after release from the synchronization procedure and correlating the increase in gene dosage with the physical map of the chromosome, progression of the replication fork could be visualized and the rate of progression determined. Their results suggest that, in the absence of gyrase, the rate of chromosomal replication fork progression is decreased to one-third the initial value, but replication, presumably now supported by Topo IV, can still progress over long distances. Inhibition of both gyrase and Topo IV caused a complete cessation of fork progression. To assess whether Topo IV-supported replication fork progression resulted from the elimination of (+)sc or precatenanes, the authors examined the influence of the absence of Topo IV and gyrase activity on the accumulation of (+)sc in intracellular plasmid DNAs. Accumulation of (+)sc, presumably resulting from an imbalance in the removal of supercoils generated during transcription on the plasmids, required elimination of both activities. Because neither Topo I nor Topo III is expected to have the ability to relax (+)sc, the authors argued that Topo IV was supporting replication fork progression by removing (+)sc, not precatenanes.

These studies challenge two previous tenets of intracellular management of topology: that only gyrase supports replication fork progression and that Topo IV prefers to work on precatenanes. With respect to the latter point, previous studies established that precatenanes do arise during the replication of small plasmid DNAs в природних умовах і в пробірці ( Peter та ін., 1998). Whereas Khodursky та ін. (2000 ) demonstrated that Topo IV bound to (+)sc and (–)sc with equal avidity, other studies show that Topo IV binds fivefold better to right-handed catenanes compared with (+)sc ( Hiasa and Marians, 1996 ). It has also been demonstrated в пробірці that Topo IV, but not gyrase, can unlink precatenated DNA ( Nurse та ін., 2003 ) and that precatenane removal can support fork progression ( Hiasa and Marians, 1996 ). Interestingly, a study that examined the position of etoposide-induced Topo II cleavage sites on plasmid DNA replicating in Ксенопус egg extracts concluded that the enzyme was working by eliminating precatenanes ( Lucas та ін., 2001 ). Biochemically, Topo IV is the direct bacterial ancestor of the eukaryotic Topo II ( Peng and Marians, 1995 ). Looking at the microarray data on fork progression through the lens of the previous data on precatenanes, we need to consider that perhaps precatenanes do not arise during chromosomal replication. The anchoring of the replication factory in the centre of the cell could conceivably prevent conversion of (+)sc to precatenanes by diffusion behind the replisome. This possibility will be discussed again below.

New single-molecule techniques of investigating topoisomerase action have delivered interesting and important information. In these experiments, a long DNA (≈ 40 kbp) is stretched between a glass slide and a magnetic bead floating above the slide. The bead can be rotated by a magnet. Thus, when a single molecule of duplex DNA is rotated, either (+) or (–)sc are generated to compensate for either the underwinding or the overwinding of the DNA ( Strick та ін., 2000). A slightly different system is used to form braids between two duplex DNAs ( Charvin та ін., 2003 Stone та ін., 2003). Here, both molecules are attached to two beads, one is held in an optical trap and the other is held by a micropipette. Rotation of the micropipette generates a braid that is akin to the interwinding of two DNA duplexes in a catenane. Variation in topology corresponds to the distance between the bead and the slide in the former case and between the two beads in the latter case, both of which are recorded by a video camera.

In single-molecule experiments, Crisona та ін. (2000 ) demonstrated that Topo IV relaxed (+)sc at a rate of three strand passage events s −1 , 20-fold greater than the rate for relaxation of (–)sc. This preference for left-handed crossings of the duplex as opposed to right-handed ones was dramatically illustrated by the activity of Topo IV on braided DNAs ( Stone та ін., 2003). When the braids were intertwined by a moderate number of linkages, the preference was nearly absolute. Only the left-handed braid was unlinked. Unlinking of the right-handed braid required that the DNAs be extensively intertwined so that compensatory left-handed supercoils were generated. Similar observations were made by Charvin та ін. (2003 ). To account for the fact that it has been demonstrated quite clearly that Topo IV is active on right-handed substrates, such as the catenanes that arise during θ-type DNA replication, Crisona та ін. (2000 ) showed that, at the catenane density typically found during replication of small plasmid DNAs, the angle of crossing adopted by the catenated duplexes will be close to random. This phenomenon occurs because, at these low densities of specific catenation, the crossings are relatively mobile, the angle of intersection of the duplex DNAs could reflect that of either a right-handed or a left-handed crossing high catenation densities will tend to be more restrictive. Thus, despite the clear chiral sensing exhibited by the enzyme, it will still be able to unlink the nominally right-handed crossings.

The argument that Topo IV relaxes (+)sc in the cell has received significant support from these single-molecule analyses. The preference of Topo IV for left-handed crossings allows it to be active on the positive supercoils that arise during replication yet spare the negative supercoils, thus preserving the overall negative superhelicity of the chromosome as a driving force for DNA metabolism. The rate of relaxation of positive supercoils determined is similar to the rate of unlinking of DNA braids (2.5 and one strand passage events s −1 for left-handed and right-handed braids respectively). These rates are consistent with the overall decatenation rate during plasmid replication в природних умовах ( Zechiedrich and Cozzarelli, 1995 ). Such rates suggest that the action of 50 or so molecules of Topo IV on each half of the chromosome (or within the topological domains where replication is ongoing) would be sufficient to support replication fork progression completely.

Whereas numerology of this sort is seductive and appears to give a satisfactory answer, it does not seem that all issues have been resolved. Obviously, there are many factors in the cell that can modify the activity of the enzymes in question. Nevertheless, based on the microarray and single-molecule analyses, a reasonable model is that removal of (+)sc by gyrase and Topo IV followed by the removal of a few residual catenanes by Topo IV is the pathway taken by the cell to deal with the variations in Lk produced by replication. In this model, all topological entanglements between the sisters are eliminated at the end of replication, and complete segregation could be achieved immediately. However, the picture in the cell seems to be more complex.

Khodursky та ін. (2000 ) found that Topo IV supported fork progression at one-third the rate observed when both gyrase and Topo IV were present, yet the rates derived from the single-molecule analysis and the concentration of Topo IV in the cell ( Espeli та ін., 2003a ) suggest that it should be able to support fork progression at the maximum rate. Unfortunately, no similar single-molecule analysis of gyrase has been reported, therefore it is difficult to assess whether such one-to-one correspondences can be made. It will be important to determine whether the rate of (+)sc unlinking by gyrase is in the range of 4 s −1 , as predicted by combining the microarray and single-molecule observations discussed above. However, the reduction in the rate of fork progression observed when gyrase is inactivated suggests that most of the 1000 or so molecules of Topo IV present in the cell ( Espeli та ін., 2003a ) do not have free access to the DNA. Also, in these experiments, unlike when both gyrase and Topo IV were active, Topo IV-supported fork progression ceased after some time and replication was not completed.

Observations made on the consequences of partial inactivation of gyrase activity в природних умовах challenge the view that Topo IV is involved in the support of replication fork progression. Grompone та ін. (2003 ) have shown that, in a context in which the activity of gyrase is decreased slightly (a temperature-sensitive gyrB mutant is held at the semi-permissive temperature), cell growth is completely dependent on the replication restart machinery (for a review of replication restart, see Cox та ін., 2000). This observation suggests that, when gyrase is not fully functional, (+)sc accumulate ahead of the fork and block progression. If Topo IV is able to support fork progression at one-third of the wild-type rate by removing (+)sc when gyrase is totally absent, why is it not able to compensate for a slight reduction in gyrase activity? Grompone та ін. (2003 ) suggest that the partially inactive gyrase is unable to keep pace with the generation of (+)sc such that an excess of (+)sc stalls the replication fork, the components of the replisome dissociate, and the (+)sc are then transformed into precatenanes allowing subsequent assembly of a new replisome by the restart machinery and resumption of replication fork progression. These observations suggest that Topo IV does not compensate for either the absence or the debilitation of gyrase during replication fork progression by removing either (+)sc or precatenanes. This interpretation implies that precatenanes are not a barrier to replication and that the Topo IV present in the cell is not free to interact with the DNA at all times.

Support for the restriction of Topo IV activity comes from studies from this laboratory suggesting a spatial and temporal regulation of Topo IV activity ( Espeli та ін., 2003a ). Quinolone-induced, DNA gyrase- or Topo IV-mediated cell killing as a function of the cell cycle was measured to determine when gyrase and Topo IV activity was manifest. An isogenic pair of strains was used in which the GyrA subunit of DNA gyrase was either sensitive or resistant to the quinolone norfloxacin and also carried a temperature-sensitive dnaC mutation that allowed synchronization of cell growth by a triple temperature shift procedure. Formation of quinolone-induced double-strand breaks correlates with the cytotoxicity of these drugs and has been shown to occur when the replication fork encounters the frozen topoisomerase–quinolone–DNA complex ( Hiasa та ін., 1996 Hiasa and Shea, 2000 ). When gyrase was sensitive to norfloxacin, cell killing was coincident with the onset of replication, consistent with random positioning of gyrase on the DNA. On the other hand, when gyrase was resistant to norfloxacin, cell killing occurred only late in the cell cycle, implying that Topo IV was restricted from access to the DNA until the end of the replication cycle. This interpretation was supported by the use of TUNEL to label all quinolone-mediated, SDS-induced, double-strand breaks on the nucleoid across the cell cycle. This technique should measure residence of any gyrase or Topo IV molecule on the DNA. The results were in complete agreement with the cell killing experiments. This regulation of Topo IV activity appears to be linked to the specific localization of its subunits, ParE and ParC, in the cell. In most cells, ParC localized to the replication factory in a manner that was dependent on the τ and γ subunits of the cellular replicase. Surprisingly, ParE localization was not the same. ParE formed foci in the DNA-free spaces of the cell, primarily in proximity to the forming septum. We have proposed that temporal regulation of Topo IV activity is enforced by a spatial regulation that keeps the two subunits apart for the majority of the cell cycle and allows them to associate in the centre of the cell when decatenation is absolutely required at the end of replication. Consistent with this model is the finding that a mutation in dnaX (encoding τ and γ) that does not affect replication impairs chromosome decatenation and causes ParC to become delocalized.

Another interesting possibility is that components of the septal ring are important for both the subcellular localization and the activity of Topo IV. We have demonstrated an interaction between ParC and the C-terminal domain of FtsK ( Espeli та ін., 2003b ). FtsK is a bifunctional protein composed of three domains ( Liu та ін., 1998). The N-terminal transmembrane domain is required for cell viability and is presumed to be involved in closure of the septal ring ( Draper та ін., 1998). The C-terminal part of FtsK is cytoplasmic and is required for XerCD-catalysed resolution of chromosomal dimers at dif ( Steiner та ін., 1999). This portion of FtsK is composed of two domains: a proline- and glutamine-rich domain of unknown function and a 500-amino-acid, C-terminal, AAA domain (domain 3, FtsKC) that is necessary for normal chromosome segregation ( Liu та ін., 1998 ), in part because of its effect on XerCD recombination at dif ( Recchia та ін., 1999). FtsKC is a hexameric DNA-dependent ATPase that can alter the topology of DNA and affect the direction of XerCD-catalysed resolution в пробірці ( Aussel та ін., 2002 ). Topo IV-catalysed decatenation of multiply linked DNA dimers в пробірці is stimulated two- to threefold by FtsKC, whereas the gyrase-catalysed reaction is not ( Espeli та ін., 2003b ). Therefore, FtsK may capture Topo IV at the septum and participate in chromosome decatenation. This possibility is supported by the recent demonstration that, in the presence of FtsKC, XerCD can decatenate plasmid DNAs that carry a dif site (Ip та ін., 2003). This exciting observation raises the interesting possibilities that FtsK participates directly in chromosome decatenation, possibly with the XerCD–FtsK combination acting as a fail-safe decatenation activity, and that there may be a specific locus in the cell at which all chromosome decatenation occurs.

How can one reconcile the various observations that indicate on the one hand that Topo IV is free to access the chromosome and participates in supporting replication fork progression and indicate on the other hand that access of Topo IV to the DNA is restricted to late in the cell cycle when it probably acts only on catenanes? Perhaps the key to doing so lies in the fact that, under the conditions used by Khodursky та ін. (2000 ) for their measurements of Topo IV-supported replication fork progression, gyrase was inactivated, resulting in global relaxation of the chromosome (i.e. negative supercoiling would be lost rapidly). Recent observations suggest that proper chromosome dynamics require negative supercoiling. MukB is an SMC-like protein thought to be involved in packaging the sister chromosomes shortly after they exit the replication factory ( Ohsumi та ін., 2001 ). Мутації в mukB are temperature sensitive, displaying chromosome segregation defects and producing anucleate cells at the non-permissive temperature ( Niki та ін., 1991 ). Suppression of the mukB phenotypes is achieved by inactivating Topo I ( Sawitzke and Austin, 2000 ). Suppression results from an increase in negative supercoiling because partial inactivation of gyrase in mukB topA double mutants restores the mukB фенотипи. Thus, it would seem that probing gyrase and Topo IV function by inactivating gyrase comes at the price of perturbing normal chromosome dynamics. One must therefore consider the possibility that specific regulation of Topo IV localization is lost under these conditions. Furthermore, the presumed massive entanglement of the sister chromosomes that ensues subsequent to inactivation of gyrase may also account for why the presumed Topo IV-supported replication fork progression petered out in the microarray experiments of Khodursky та ін. (2000 ). Grompone та ін. (2003 ) did not inactivate gyrase completely thus, it is possible that, under their conditions, there was sufficient global negative supercoiling to maintain proper chromosome dynamics.

Understanding bacterial chromosome dynamics is a newly burgeoning endeavour. Recent observations raise the possibility that the chromosome may be acted upon by forces that induce physical stress on the DNA. SetB is an integral membrane protein that we identified in a screen for high-copy suppressors of the temperature-sensitive and partition phenotypes of the parC1215 allele ( Espeli та ін., 2003c ). Inactivation of this protein provokes a delay in chromosome segregation, whereas its overproduction induces nucleoid stretching and disintegration. SetB localizes in the cell with a helical pattern and interacts by two-hybrid analysis with MreB. ParM, an MreB homologue encoded by the R1 plasmid, was recently shown to drive plasmid partition by filament polymerization that pushed the sisters apart ( Moller-Jensen та ін., 2002 ). Furthermore, expression in otherwise wild-type cells of mutant forms of MreB that are unable to polymerize induces defective nucleoid separation and cell division ( Kruse та ін., 2003). We therefore favour the hypothesis that SetB participates in the application of a force to the chromosome that helps to drive chromosome segregation. Topological domains that are under stress will assume conformations directed at relieving that stress. Thus, if such a system operates, one must consider that the form and distribution of topology in the replicating chromosome could be distinct from what we now imagine. Along these lines, rescue of the parC temperature-sensitive strain by overexpression of SetB is hypersensitive to the quinolone norfloxacin (unpublished data), suggesting that the requirement for gyrase had become particularly acute. One possible interpretation of this observation is that the excess tension applied to the chromosome when SetB is overexpressed induces a conformation that allows gyrase to serve as the cellular decatenase.

A description of how replication topology is handled in the cell that could fit all the data and the interpretations discussed here is that gyrase operates to remove the (+)sc formed during replication, that any precatenanes formed do not interfere with replication and are removed only at the end of the cell cycle, probably when they have been converted to catenanes, and that Topo IV acts primarily on catenanes (Fig. 1). The primary principle governing how the excess positive windings generated by replication are distributed would seem to be linked to the nature of chromosomal domains. If future single-molecule studies support the contention that gyrase operates at about two to four strand passage events s −1 , then any topological domain that contains an advancing replication fork requires the simultaneous action of 13–25 gyrase molecules. Let us take 20 as an average value. Because gyrase wraps 150 bp of DNA about itself ( Liu and Wang, 1978 ), these molecules will occupy 3 kbp of unreplicated DNA.

Possible distribution of DNA topology, DNA gyrase and Topo IV in the cell. The cartoon depicts a bacterial cell that is nearing completion of cytokinesis. The cell is being divided by the invaginating septal ring. Catenanes between the two sister chromosomes that are undergoing partition are being removed by Topo IV that is anchored at the septal ring by virtue of its interaction with the C-terminal, AAA domain of FtsK. The DNA translocation activity of this domain of FtsK may participate directly in the decatenation reaction. Replication has initiated on the sister chromosomes undergoing partition. The second-generation sister chromosomes are organized into negatively supercoiled topological domains that are possibly anchored by DNA gyrase. The topological domain that is ahead of the replication fork (i.e. between the replication factory and the domain barrier in the cartoon) is positively supercoiled. Gyrase is concentrated in this domain in order to provide sufficient unlinking activity. The drawing is not to scale. Duplex DNA is represented by a single line. Newly replicated regions of the chromosomes are in red. The invaginating septum is represented by the grey rectangles.

What happens when the advancing fork squeezes the gyrase consortium up against the domain barrier? In part, the result depends on both the behaviour of the bound gyrase and the nature of the domain barrier itself. One possibility is that, as the gyrase molecules presumably dissociate to allow passage of the fork, all the duplex windings of the non-replicated region are converted to precatenanes, 300 of them. Such a situation would seem to be untenable. This conversion would require 300 rotations of the replication fork per domain, something that is probably unlikely. In addition, if chromosomal domains are of the order of 50 kbp, the arithmetic argues that there would be in the range of 25 000 precatenanes converted to catenanes at the end of replication. Interestingly, given the rates measured for Topo IV unlinking of braided DNA, 40 or so Topo IV molecules could remove all those linkages in about 10 min, a period that roughly corresponds to the D period of the кишкова паличка cell cycle ( Cooper and Helmstetter, 1968 ). On the other hand, the extent of linkage between the sister chromosomes implied by this density of precatenanes would seem to be a force for sister chromosome cohesion that would act against extrusion of the sisters into opposite halves of the cell as posited in models of replication-driven chromosome partition ( Lemon and Grossman, 2001 ).

A more likely possibility is that domain barriers are not fixed and can slip forward as the fork moves forward. Perhaps the pressure of the gyrase consortium encountering the domain barrier acts as some type of trigger in this process or perhaps the domain barrier is the gyrase consortium itself. Under these circumstances, gyrase molecules that dissociate to allow passage of the fork could rebind further downstream. In this manner, there would be little slop of positive supercoils over to precatenanes. Clearly, many questions about the management of DNA topology in the cell remain to be answered.


No Time to Relax

To get a sense for supercoiled DNA, imagine twisting a piece of string. Let the string go, and it unwinds. Twist it enough, and it folds back on itself. The degree of twist puts stress on the string, which governs the shape it takes.

DNA behaves in a similar fashion. Like the string, it prefers to be in its most relaxed state — the iconic double helix. But DNA rarely gets to relax. It’s subject to a continual onslaught of molecules that bind it — the enzymes that untangle, unwind and then replicate DNA the molecules that mark which genes are active and which are silent and the proteins that pack the lengthy molecule into a manageable size. All of these molecules contort DNA into new shapes, blocking it from the repose of the simple double helix.

Irobalieva RN et al., Nat. Comm. 2015

Video: This simulation illustrates the dynamic dance of tiny circles of supercoiled DNA.

These interactions represent the inner workings of the cell, the basis of all life. How the cell decides to activate a certain gene, for example, involves a complex assembly of molecules in the right place at the right time. Protein-DNA interactions also present prime targets for drugs as well as insights into disease. Imagine a drug that could block activation of a cancer-linked gene without interfering with other genes.

Unfortunately, these interactions are very difficult to study because biological molecules morph shapes so easily. A mechanic would have a hard time fixing a car if the parts constantly mutated.

To capture the complex structure of these nanoscale interactions, scientists typically crystalize the molecules, freezing their shape for the camera. The vast majority of these studies use short strands of relaxed DNA — the standard double-helix form — because they’re easy to work with and cheap to make. But that may not capture the true picture relaxed DNA often behaves differently than that found in the cell, contorted around all manner of proteins.

Zechiedrich and her collaborators have spent the last two decades making small pieces of supercoiled DNA, whose behavior better mimics DNA in the living cell. Essentially, they take a short strand of DNA and twist it — once, twice, three times or more — either with or against the coil. Then they glue the ends together. The end result is a tiny circle of DNA coiled in one direction or another. Zechiedrich, her collaborator and Baylor colleague Jonathan Fogg and others have shown that these twisted coils dance, shimmying through a microscopic ballet. Each molecule can assume a variety of shapes, from simple circles to figure eights, racquets, handcuffs, needles and rods. “Linear DNA is stiff and inflexible,” said De Witt Sumners, a mathematician at Florida State University in Tallahassee. “But when you get it bent into a small circle, the duplex opens up and adopts a large number of interesting shapes — this is completely unexpected.”

The newest study from Zechiedrich’s lab provides the clearest picture yet of these tiny rings. The researchers captured microscopic images of individual circlets in a variety of diverse shapes. Pairing the images with sophisticated computational models created by collaborator Sarah Harris, a biologist at the University of Leeds, they were able to predict the precise movements of each molecule.

Though scientists already knew bits and pieces of how supercoiled DNA functions, the combination of microscopy and modeling in the new paper helps to create a more precise picture. “For a large part of the biological community, seeing is believing,” said Stephen Levene, a biophysicist and bioengineer at the University of Texas, Dallas, who was not involved in the study. “You can show math models, but unless you have some convincing structural data, it’s hard to get people to appreciate what’s going on.”


The dynamic interplay between DNA topoisomerases and DNA topology

Topological properties of DNA influence its structure and biochemical interactions. Within the cell, DNA topology is constantly in flux. Transcription and other essential processes, including DNA replication and repair, not only alter the topology of the genome but also introduce additional complications associated with DNA knotting and catenation. These topological perturbations are counteracted by the action of topoisomerases, a specialized class of highly conserved and essential enzymes that actively regulate the topological state of the genome. This dynamic interplay among DNA topology, DNA processing enzymes, and DNA topoisomerases is a pervasive factor that influences DNA metabolism in vivo. Building on the extensive structural and biochemical characterization over the past four decades that has established the fundamental mechanistic basis of topoisomerase activity, scientists have begun to explore the unique roles played by DNA topology in modulating and influencing the activity of topoisomerases. In this review we survey established and emerging DNA topology-dependent protein–DNA interactions with a focus on in vitro measurements of the dynamic interplay between DNA topology and topoisomerase activity.

Це попередній перегляд вмісту підписки, доступ через вашу установу.


Перегляньте відео: Математика для всех. Алексей Савватеев. Лекция. Конечные и бесконечные множества (Листопад 2022).