Інформація

Як трансгенні трансформації викликають нецільові фенотипи?

Як трансгенні трансформації викликають нецільові фенотипи?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я читав, що вставки трансгену можуть викликати нецільові мутації, які призводять до того, що фенотип надмірно приписується трансгену, напр. збільшення тривалості життя приписують надмірній експресії Sir2 (Burnett et al, 2011, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21938067). У цьому конкретному дослідженні вони кілька разів перехрестили трансгенний штам з диким типом, щоб усунути ці нецільові ефекти, зокрема названа мутація в Dyf2.

У мене поганий досвід генетики, тому я не розумію, як вставки трансгену можуть викликати нецільові мутації, ані як ауткросинг може ізолювати передбачувану мутацію.


The C.elegans використаний у дослідженні, на яке ви посилалися, спочатку було зроблено Tissenbaum & Guarente з використанням протоколу гамма-опромінення.

Коротше кажучи, протокол передбачає ін’єкцію бажаної конструкції ДНК в гонаду хробака з наступним гамма-опроміненням хробаків.

При радіаційному впливі геномна ДНК хробака розривається у випадкових місцях і піддається репарації відповідними клітинними ферментами, на останньому етапі екзогенна ДНК може бути інтегрована (лігована) в геном. Проте геномна ДНК може також набувати випадкових мутацій через випромінювання. Це як вставки трансгену можуть викликати нецільові мутації в цьому випадку.

З іншими організмами або клітинами протоколи відрізняються. Для інженерії клітин ссавців, наприклад, випромінювання ніколи не використовується, але все-таки вам потрібно створити розриви в геномі, щоб відредагувати його. Залежно від методу "частота за межами цільового рівня" даного експерименту може змінюватися, але вона ніколи не дорівнює нулю (поки що немає).


Коли ви схрещуєте мутантний організм з організмом дикого типу (зворотне схрещування), у кожному потомстві половина алелей походить від батьківського мутанта, а половина — від дикого типу. Інший спосіб поглянути на це — сказати, що приблизно половина нащадків буде містити будь-яку дану мутацію, припускаючи, що вона гетерозиготна в мутантному організмі і не спричиняє різницю придатності.

Через це в середньому щоразу, коли ви повертаєтеся до дикого типу, ви втрачаєте половину мутацій. Імовірність мутації, яка залишиться після кількох раундів зворотного схрещування, дуже швидко зменшується (0,5 після одного покоління, 0,25 після 2, 0,125 після 3, 0,0625 після 4, 0,03125 після 5 тощо).

У кожному раунді зворотного схрещування ви тестуєте потомство і вибираєте тих, які мають передбачувану мутацію, і використовуєте їх для наступного раунду, тому, хоча ймовірність збереження передбачуваної мутації залишається високою (~1,0), ймовірність збереження ненавмисних мутацій дуже швидко зменшується. Все це припускає, що нецільові мутації знаходяться в різних хромосомах або досить далеко від передбачуваної мутації (незчеплені), щоб вони відокремлювалися окремо і не переносилися в покоління зворотного перехрещення шляхом «перетягування зчеплення».


Генетичні маніпуляції Soc1-подібні гени сприяють фотосинтезу в квітках і листках і підвищують стійкість рослин до високих температур

Швидке підвищення середньої глобальної температури в результаті глобального потепління загрожує продуктивності рослин (Li та ін., 2015). Хлоропласти і білки хлоропластів пов’язані зі стресами навколишнього середовища (Alexia та ін., 2019 Гон та ін., 2020). Багато білків теплового шоку (HSP) пов’язують з розвитком хлоропластів і покращують толерантність рослин до теплового стресу при високій температурі (Shen та ін., 2015 Чжун та ін., 2013), тоді як не повідомляється, що жоден ген не сприяє розвитку хлоропластів і підвищує толерантність до високої температури синхронно. Вплив високої температури на хлоропласт має особливе значення, оскільки фотосинтез часто пригнічується до того, як інші функції клітини будуть порушені (Чжан та ін., 2010). Таким чином, стимулювання біогенезу та фотосинтезу хлоропластів є потенційним методом підвищення стійкості рослин до тепла. Раніше ми виявили, що надмірне вираження SOC1 або SOC1-подібний Гени в рослинах, що перебувають у тепловому стресі, індукують біогенез хлоропластів у пелюстках (Wang та ін., 2019). Однак невідомо, чи порушений апарат фотосинтезу і чи підвищена термотолерантність рослин у трансгенних рослин. У нашому нинішньому дослідженні транспластомний (укриття GFP репортерський ген, керований psbA промотор хлоропласту), мультигенний трансгенний тютюн (Fbp21 ген був введений в геном чистої лінії GFP транспластомне мічення тютюну nFbp21*pGFP) та трансгенна надекспресія петунії FBP21 ген були отримані шляхом хлоропластної та ядерної трансформації. Крім того, трансгенні рослини (Fbp21-мічені F21 і Fbp21*22-мічені F21_22 у цій статті) містять SOC1-подібний гени та дані RNA-Seq пелюсток, про які повідомлялося раніше (Wang та ін., 2019 р.), також були інтегровані. Нарешті, було проведено серію експериментів, пов’язаних із секвенуванням РНК у листках, біологічним і фізіологічним, анатомічним і фенотипічним визначенням.

Коли рослини вирощували при високій температурі (40°C дні/28°C ночі), було показано, що лише нефотосинтетичні пластиди, що містять пластоглобули, були помічені в рожевих пелюстках контрольних рослин тютюну. У зелених пелюстках ми спостерігали морфологічно нормальні хлоропласти SOC1-подібний ген трансгенних рослин тютюну (Малюнок 1а). Хлоропласти в зелених пелюстках nFbp21*pGFP спостерігалося, що транспластомний тютюн випромінює червону та зелену флуоресценцію одночасно при високій температурі (Малюнок 1b). Це вказує на те, що гени хлоропластів експресувалися в цих спричинених тепловим стресом пластидах у пелюстках. Максимальні значення фотохімічної ефективності (Фv/Фм) визначення також показало, що фотосинтез відбувався в пелюстках, що містять хлоропласти (Малюнок 1c і d). Більшість генів фотосинтезу були різко підвищені в зелених пелюстках, що містять хлоропласти (Малюнок 1e). Імуноблот-аналіз також показав, що багато білків, пов’язаних з фотосинтезом, синтезуються в зелених пелюстках (Малюнок 1f).

Термостійкий аналіз показав, що SOC1-подібний ген трансгенного тютюну (F21 і F21_22) істотно відрізнявся від контрольного тютюну своєю толерантністю до тривалого екстремального теплового стресу. Для 2-тижневих рослин тютюну більше світло-жовтих проростків було помічено у тютюну дикого типу, ніж у трансгенних ліній після теплового стресу (Малюнок 1g). Фvм значення в трансгенних лініях також були значно вищими, ніж у дикого типу (рис. 1g та h). Нижчий витік електроліту (EL) (Рисунок 1i) і вищий рівень виживання (Рисунок 1j) свідчать про те, що цей 2-тижневий трансгенний тютюн мав підвищену термостійкість. Коли рослини вирощували при нормальній температурі, більше хлоропластів у клітинах листя трансгенного тютюну (включаючи тютюн F21 або F21_22) також спостерігалося в nFbp21*pGFP транспластомний тютюн за червоною та зеленою флуоресценцією порівняно з GFP транспластомний тютюн (Малюнок 1k). Ці результати свідчать про надмірну експресію Подібний до Soc1 гени сприяє біогенезу хлоропластів у трансгенних листках. При вирощуванні при високій температурі хлоропласти листя трансгенного тютюну (також спостерігаються у nFbp21*pGFP) підтримував нормальний вигляд і впорядкований розподіл і випромінював більше зеленої флуоресценції (Малюнок 1k). Ці спостереження показують, що гени хлоропластів можуть нормально експресуватися при високій температурі, тоді як хлоропласти в листках контрольного тютюну стали набряклими, кулястими та неправильними. Це відповідало тому, що повідомили Квон та його колеги GFP транспластомний тютюн (Kwon та ін., 2013). Структурні зміни хлоропластів та їх розсіяний розподіл у контрольному тютюні (Малюнок 1k) свідчать про більш високу нестабільність різноманітних клітинних мембран та пошкодження клітин під впливом нагрівання при високій температурі.

Реакція на високу температуру 6-тижневих рослин тютюну також помітно відрізнялася між контрольним та трансгенним тютюном (рис. 1l). Багато генів фотосинтезу були різко посилені в листках трансгенних рослин, що ростуть при високій температурі (Малюнок 1m). Імуноблот-аналіз показав, що білки, пов’язані з фотосинтезом, накопичувалися в трансгенних рослинах (Малюнок 1n). При безперервному тепловому стресі (45°C протягом 9 год), Фv/Фм значення також були значно вищими в листках трансгенних рослин тютюну (Малюнок 1o). Часовий ряд визначення чистої швидкості фотосинтезу (Pn) показав, що рівень Pn у листках трансгенних рослин тютюну був вищим, ніж у дикого типу (Малюнок 1p). Магній входить до складу хлорофілу і необхідний для фотосинтезу (Leonard, 1954), а більший вміст магнію також було виявлено в листках F21 трансгенних рослин тютюну (Рисунок 1q). Взявши разом, ці результати свідчать про це SOC1-подібний генні трансгенні рослини тютюну мають підвищену фотосинтетичну здатність в умовах теплового стресу.

Значення EL для листя 6-тижневого трансгенного тютюну було нижчим, ніж у дикого типу після теплового стресу (Малюнок 1r). Аналіз RNA-seq показав, що гени, що кодують білки теплового шоку, також значно активізувалися в листках трансгенних рослин тютюну під час теплового стресу (Малюнок 1s). Аналіз ГХ-МС показав, що вміст проліну був значно вищим у SOC1-подібний ген трансгенних рослин тютюну (Малюнок 1t). Варто зазначити, що під час фази бутонізації трансгенні рослини тютюну не були порушені та нормально цвіли під час теплового стресу (12-годинний світловий цикл протягом 15 днів). Навпаки, рослини тютюну дикого типу не цвіли або погано цвіли в умовах теплового стресу (Малюнок 1u).

Крім того, трансгенна петунія-надекспресія Fbp21 Ген також був більш стійким до температури на різних фазах росту, ніж рослини петунії дикого типу (рис. 1v та w). Найвищий рівень виживання (96,60%) був зафіксований для 2-тижневої трансгенної петунії після теплового стресу (Малюнок 1v). Для 6-тижневої розсади петунії жоден з сіянців петунії дикого типу не вижив через 3 дні під впливом високої температури (Малюнок 1w). Подібно до надмірної експресії тютюну SOC1-подібний гени, трансгенна петунія-надекспресія Fbp21 ген також утворив світло-зелені пелюстки під час теплового стресу (Малюнок 1x).

У попередньому дослідженні ми вперше повідомили про це SOC1-подібний гени сприяють біогенезу хлоропластів у пелюстках, які перебувають у тепловому стресі (Wang та ін., 2019). У цьому дослідженні ми показуємо, що клітина, що містить підвищену кількість хлоропластів, частіше спостерігається в листках Подібний до Soc1 генних трансгенних рослин, ніж у рослин дикого типу і тому SOC1-подібний гени посилюють фотосинтез і гени, пов’язані з тепловим шоком, покращують фотосинтез рослин і пом’якшують пошкодження хлоропласту тепловим стресом. Наші результати продемонстрували, що суперрослини з пелюстками, що містять хлоропласти, більш високим вмістом хлорофілу, посиленням фотосинтезу та підвищенням стійкості до тепла можуть бути синхронно досягнуті за допомогою генної інженерії. Ми показали, що квіти рослин можуть здійснювати фотосинтез для подальшого покращення ефективності використання вуглецю в умовах теплового стресу і що надмірна експресія SOC1-подібний гени зменшують шкідливий вплив теплового стресу на хлоропласти і посилюють фотосинтез у рослинах. Наше спостереження дає нове уявлення про механізм перехресних перешкод між високою температурою, функціональним біогенезом хлоропластів рослин, фотосинтезом рослин і стійкістю рослин до тепла. Виробництво термостійких рослин матиме велике екологічне та економічне значення в умовах зростаючої загрози глобального потепління.


Параметри доступу

Отримайте повний доступ до журналу на 1 рік

Усі ціни є цінами НЕТТО.
ПДВ буде додано пізніше під час оформлення замовлення.
Розрахунок податку буде завершено під час оформлення замовлення.

Отримайте обмежений за часом або повний доступ до статті на ReadCube.

Усі ціни є цінами НЕТТО.


Результати

Система pNP ефективно працює в сомі та зародковій лінії

Умовні трансгенні RNAi системи в дрозофіла може тимчасово і просторово збивати цільові гени за допомогою бінарної системи Gal4/UAS. Без Gal4 шпилька, закодована послідовністю ДНК, що знаходиться нижче за UAS, не була б експресована, що дозволило б генерувати та підтримувати тисячі трансгенних ліній РНК на основі векторів pVALIUM 2,4. Однак ми помітили, що 15,8% трансгенних ліній RNAi, заснованих на системі pVALIUM20 в центрі мух Цинхуа (THFC), не можуть підтримувати гомозиготність (додаткові дані 1). Тим часом, 8,5% трансгенної бібліотеки RNAi на основі ɸC31 і довгої дволанцюгової РНК (dsRNA) на основі шпильки (колекція KK) у Віденському ресурсному центрі дрозофіли (VDRC) є гетерозиготними, а 17,9% трансгенних ліній RNAi на основі системи pVALIUM20 у VDRC є гетерозиготними (додаткові дані 1). Усі ці вектори, що використовуються в раніше розроблених трансгенних RNAi системах, засновані на векторі pUAST, промотор якого складається з тандемних повторів UAS, за якими слідує коробка TATA з Дрозофіла hsp70 ген 1,4 . З огляду на те, що hsp70 базальний промотор може спрямовувати транскрипцію без індукції Gal4 в певних тканинах при стандартній температурі 25℃ 9 , ми припустили, що летальність цих гомозиготних трансгенних ліній RNAi може бути пов’язана з непрохідною активацією hsp70 базальний промотор.

Щоб перевірити цю можливість, ми замінили hsp70 базальний промотор у векторі pVALIUM20 з a дрозофіла синтезований серцевий промотор (DSCP) 13 . Оскільки hsp70 базальний промотор довший, ніж DSCP, ми додали спейсерну послідовність 100 bp перед UAS, щоб забезпечити відповідну робочу відстань між промотором та циганськими ізоляторами. Щоб досягти точної обробки та експресії множинних shRNA 14, ми ампліфікували міжгенний лінкер між miR-2a-1 і miR-2b-2 і клонували його нижче за каркасом miR1. За допомогою цих оптимізацій ми позначили отриману конструкцію як вектор pNP (додатковий рис. 1).

Ми розробили та створили стабільні трансгенні лінії, використовуючи цю систему для експресії shRNA, націлених на набір генів, що кодують білок, з відомими фенотипами втрати функції в системі крила, ока, нейронів, кишечника, яєчка та яєчників. По-перше, нокдаун egfr, Hp1a, kis, Notch у крилі, що приводиться в рух специфічним для крила Gal4s, викликав серйозний дефект крила (рис. 1а), що узгоджується з попереднім описом 4,15,16,17,18 . Крім того, орієнтація на білий, світлий, їжак (hh) за допомогою ey-Gal4 створив той самий фенотип ока, що й у попередніх звітах (рис. 1b) 19,20,21, що свідчить про те, що система трансгенної РНК pNP може ефективно виснажувати гени в сомі. Ми також обрали кілька генів з відомими фенотипами втрати функції для аналізу ефективності системи pNP в нейронах. Відповідно до попередніх звітів 1, 22, 23, усі вони викликали летальність при керуванні elav-Gal4, що вказує на те, що pNP ефективно працює в нейронах (додаткова рис. 2а). Далі ми перевірили ефективність системи pNP в системі стовбурових клітин кишечника, яєчка та яєчників. Ми використовували специфічний для статевих клітин nos-Gal4 для знищення piwi або бац, що значно зменшило розмір яєчників порівняно з контролем (рис. 1в), і призвело до появи мух, які не відкладали яйця (рис. 1г). Крім того, RNAi of бац збільшила кількість стовбурових клітин статевої лінії (GSC), як повідомлялося в попередніх звітах 24 , одночасно знищивши пант у яєчках за допомогою nos-Gal4 виявлено відсутність GSC і менше статевих клітин 25, а також виснаження Виїмка в кишечнику за допомогою esg-Gal4 збільшилася кількість кишкових стовбурових клітин і ентероендокринних клітин (додаткова рис. 2) 26 . Взяті разом, ці результати показують, що система трансгенної РНК pNP може ефективно та специфічно знищувати цільові гени не тільки в сомі, але й у нейронах, кишечнику, яєчках та системі стовбурових клітин яєчників.

Система pNP ефективно працює в сомі та зародковій лінії. а Приклади pNP-індукованих фенотипів крил з використанням MS1096-Gal4 або C96-Gal4. Масштабні смуги, 500 мкм. б Збити з білий, світлий або hh в оці, керований ey-Gal4. Масштабні смуги, 200 мкм. c Темнопольне зображення фенотипу яєчника зі знищенням piwi і бац контролюється nos-Gal4. Масштабні смуги, 300 мкм. d Контрольна фертильність, pNP-piwi і pNP-бац самки літають за допомогою драйвера nos-Gal4 (п = 10, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест (*с < 0,05, **с < 0,01, ***с < 0,001)

Значно знижена експресія витоку від базального промотора

Щоб порівняти базальну активність промоторів у векторах pNP і pVALIUM20, ми замінили каркас miR1 на люцифераза ген як репортер. Спочатку ми перевірили непрозору експресію люциферази у цих трансгенних мух на різних стадіях розвитку без драйвера Gal4. Як показано на рис. 2а, інтенсивність люциферази від pNP-люцифераза трансгенні мухи подібні до тварин дикого типу на всіх аналізованих стадіях розвитку, але всі їхні рівні різко збільшуються в pVALIUM20-люцифераза тварин після ембріональної стадії. Щоб перевірити потенційні тканинноспецифічні відмінності, ми розібрали різні тканини від личинок третього віку та провели аналізи люциферази. Подібні інтенсивності люциферази спостерігалися в м’язах та центральній нервовій системі (головному мозку та нервовому канаті) з обома векторами (рис. 2б). Проте ми спостерігали значно підвищену базальну експресію люциферази в слинних залозах, чоловічих статевих залозах, жіночих статевих залозах, жировому тілі та криловому диску системи pVALIUM20, що в 685, 41, 42, 167 і 4 рази вище, ніж у відповідних тканинах. із системи pNP (рис. 2б).

Значно знижена експресія витоку від базального промотора. а Відносні рівні експресії люциферази на різних стадіях розвитку pVALIUM20-люцифераза і pNP-люцифераза літає без водія Gal4 (п = 5, середнє ± s.d.). б Відносні рівні експресії люциферази в різних тканинах pVALIUM20-люцифераза і pNP-люцифераза літає на стадії личинки без водія Gal4 (п = 3, середнє ± s.d.). c Імунофарбування політенної хромосоми від pVALIUM20-Hp1a і pNP-Hp1a без індукції Gal4. ДНК візуалізували за допомогою DAPI, а HP1a фарбували мишачим моноклональним анти-HP1a (HP1a C1A9). Пунктирні кола позначають хромоцентр. Масштабні смуги, 20 мкм. d Кількісна оцінка відносної інтенсивності HP1a в хромоцентрі політенної хромосоми в pVALIUM20-Hp1a або pNP-Hp1a без драйвера Gal4 (п = 10, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест. e Відносна експресія HP1a в контролі, pVALIUM20-Hp1a або pNP-Hp1a слинна залоза без приводу Gal4 (п = 3, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест. f Відсоток гетерозиготних трансгенних ліній на основі системи pVALIUM20 та трансгенних ліній на основі системи pNP

Щоб підтвердити ці спостереження на основі репортера люциферази, ми порівняли рівні гетерохроматину білка 1 (HP1) шляхом імунного фарбування за допомогою політенних хромосом із pVALIUM20-Hp1a і pNP-Hp1a личинки без Gal4. У порівнянні з контрольним і pNP-Hp1a, рівні HP1a на політенних хромосомах з pVALIUM20-Hp1a личинок було значно зменшено (рис. 2c), а відносна інтенсивність HP1a в хромоцентри знизилася до 20% (рис. 2d), що свідчить про витікання експресії shRNA в pVALIUM20-Hp1a. Відповідно до цього спостереження ми використали аналіз qRT-PCR і помітили, що Hp1a Рівні мРНК у слинній залозі pVALIUM20-Hp1a личинок також було значно зменшено порівняно з контролем, при цьому відмінностей в Hp1a рівні мРНК спостерігали між pNP-Hp1a личинки та контрольні личинки на одній стадії розвитку (рис. 2д). Взяті разом, ці дані підтверджують, що в порівнянні з вектором pVALIUM20 система pNP значно знизила непрохідну експресію.

Щоб додатково перевірити, чи шкідлива експресія з вектора pVALIUM20 для розвитку мух, що збільшує рівень гетерозигот трансгенних тварин, ми побудували трансгенні лінії на основі pVALIUM20 і pNP проти більш ніж 300 генів відповідно (додаткові дані 2). Для кожного цільового гена ту саму shRNA клонували у вектор pVALIUM20 або pNP відповідно, і їх вставляли в той самий локус хромосоми. Порівнюючи рівень гетерозигот цих трансгенних ліній, ми помітили, що майже 15% трансгенних ліній на основі системи pVALIUM20 були гетерозиготними, що узгоджується з показником в існуючих центрах запасу, тоді як трансгенні лінії на основі системи pNP демонстрували лише 0,6% гетерозиготності ( Рис. 2f). Ці результати демонструють, що витікання експресії значно зменшується в системі pNP, а також зменшується побічний ефект, проявляється системою pVALIUM20.

Система pNP є більш ефективною, ніж система pVALIUM20

Система pVALIUM20 добре працює в соматичних клітинах і жіночій зародковій лінії для багатьох генів, однак, shRNA, націлені на деякі функціональні гени в процесі розвитку, не генерували очевидних або лише слабких фенотипів. Щоб перевірити, чи є система pNP більш ефективною, ніж система pVALIUM20, спочатку ми перевірили експресію люциферази в різних тканинах pNP-люцифераза і pVALIUM20-люцифераза трансгенних мух із використанням різних драйверів Gal4, включаючи elav-Gal4, MS1096-Gal4, Nub-Gal4, MTD-Gal4, nos-Gal4, GMR-Gal4 та esg-Gal4. Як показано на додатковому малюнку 3, обидва pNP-люцифераза і pVALIUM20-люцифераза трансгенні мухи показали високу експресію люциферази порівняно з контролем. Крім того, інтенсивність люциферази pNP-люцифераза трансгенні мухи значно вищі, ніж pVALIUM20-люцифераза тварини, які використовують ці драйвери, що вказує, що система pNP є більш ефективною. Потім ми обрали ті самі shRNA, націлені на гени, що кодують білки, відомі своїми критичними функціями під час розвитку ока, крил або яєчників, і створили трансгенні лінії за допомогою системи pNP. Цільові гени були E2F1, Upf1, aTub67C, і яйце.

У нашому першому прикладі ми перевірили E2F1, ключовий фактор транскрипції, який бере участь у регуляції фазового переходу G1-S клітинного циклу 27,28. Виснаження E2F1 в око за допомогою ey-Gal4 в pVALIUM20-E2F1 система дещо зменшила розмір очей, навпаки, pNP-E2F1 система в поєднанні з ey-Gal4 генерувала набагато менше око (рис. 3а). У нашому другому дослідженні ми проаналізували Upf1, важливий білок, який бере участь у розпаді, опосередкованому безглуздою мРНК 29 , оскільки він руйнує Upf1 за допомогою MS1096-Gal4 та pVALIUM20-Upf1 система не генерувала очевидних фенотипів. Проте ми виявили, що виснаження Upf1 використання pNP-Upf1 керована MS1096-Gal4 призвела до невеликих крил з порушеною передньою поперечною веною (a-cv) (рис. 3b). Так само виснажує aTub67C у крилі за допомогою pVALIUM20-aTub67C система і Nub-Gal4 не змогли створити жодного фенотипу, імовірно, через високу кількість цього транскрипту в клітинах. Тим не менш, подібний експеримент із використанням pNP-aTub67C система призвела до надзвичайно малих крил (рис. 3в). Ці результати свідчать про те, що система pNP виробляє сильніші фенотипи, ніж pVALIUM20 в соматичних тканинах.

Система pNP перевершує систему pVALIUM20. а Збити з E2F1 в оці за допомогою системи pVALIUM20 або системи pNP з такою ж shRNA, керованою ey-Gal4. Масштабні смуги, 200 мкм. б РНКі Upf1 у крилі за допомогою MS1096-Gal4. Масштабні смуги, 500 мкм. c Націлювання на aTub67C з системою pVALIUM20 або системою pNP, керованою Nub-Gal4. Масштабні смуги, 500 мкм. d Збити з яйце у зародковій лінії, контрольованій nos-Gal4. Масштабні смуги, 300 мкм. e Коефіцієнт фертильності контрольний, pVALIUM20- яйце і pNP- яйце самки літають за допомогою драйвера nos-Gal4 (п = 10, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест. f qRT-PCR аналіз ефективності RNAi E2F1, Upf1, aTub67C, і яйце, відповідно (п = 3, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест (*с < 0,05, **с < 0,01, ***с < 0,001)

Щоб порівняти ефективність нокдауну цих двох систем у жіночій зародковій лінії, ми перетнули лінію nos-Gal4 з pNP-яйце і pVALIUM20-яйце. Як показано на рис. 3d, яєчники з pVALIUM20-яйце самки були меншими за контрольні, але яєчники з pNP-яйце самки ще зменшилися в розмірах (рис. 3г). Отже, порівняно з кількома яйцями, виробленими з pVALIUM20-яйце самок, ми не отримали жодних яєць від pNP-яйце самки (рис. 3е). Ці результати свідчать про те, що система pNP також працює більш ефективно, ніж система pVALIUM20 у жіночій зародковій лінії. Більше того, щоб виключити можливість нецільового ефекту та врятувати фенотип, згенерований на рис. 3, ми надмірно експресували цільові гени, які нечутливі до шпильок у мух RNAi, керованих специфічними лініями Gal4. Як показано на додатковому малюнку 4, як pVALIUM20-індукований фенотип, так і фенотипи, індуковані pNP, були значно врятовані, відповідно, порівняно з лише фенотипами RNAi, що свідчить про специфічність цих RNAi. У сукупності ці результати підтверджують ефективність та специфічність цієї системи pNP.

Щоб додатково підтвердити думку про те, що система pNP більш ефективна у виснаженні генів, що цікавлять, ніж система pVALIUM20, ми кількісно визначили рівні мРНК за допомогою аналізу qRT-PCR. Хоча система pVALIUM20 значно зменшила транскрипти E2F1, Upf1, і яйце порівняно з контролем, більшого виснаження цих мРНК було досягнуто в системі pNP (рис. 3f). Для aTub67C гена, система pVALIUM20 не впливала на рівень мРНК, але спостерігалося значне зниження дисків крил за допомогою системи pNP (рис. 3f). Ці спостереження узгоджуються з вищезгаданими фенотиповими аналізами. Примітно, що як член сімейства тубулінів, aTub67C високо експресується в клітинах, системі pVALIUM20 не вдалося збити. aTub67C транскрипти (рис. 3f), що свідчить про слабкість системи pVALIUM20 щодо виснаження високоекспресованих генів. Взяті разом, ці результати свідчать про те, що система pNP є більш ефективною, ніж система pVALIUM20 як у сомі, так і в жіночій зародковій лінії.

Система pNP ефективно модулює гени високої експресії

Ефективне виснаження генів, які високо експресуються в клітинах, було проблемою в цій галузі. Спостереження, які ми зробили з aTub67C ген спонукав нас перевірити додаткові випадки для порівняння системи pNP з системою pVALIUM20. Для цього ми обрали набір генів із множинними копіями, гістон H1, H2A, H2B, H3, і H4, всі вони високо виражені в клітинах. Використовуючи однакові шпильки для кожного гена гістону, ми побудували трансгенних RNAi-мух на основі системи pNP або системи pVALIUM20. Під час керування MS1096-Gal4 знищення всіх гістонів за допомогою системи pNP викликало серйозні дефекти крил (додаткова рис. 5), що узгоджується з критичною роллю гістонів у життєздатності клітин. Як не дивно, виснажує H1 або H3 використання системи pVALIUM20 створювало слабкі або не аберантні фенотипи, одночасно знищуючи H2A, H2B, або H4 у цій системі викликала летальність перед стадією лялечки (додаткова рис. 5). Враховуючи, що система pNP є ефективнішою, але менш герметичною, ніж система pVALIUM20, ми підозрювали, що витікання експресії pVALIUM20-H2A, H2B, і H4 плюс індукована MS1096-Gal4 RNAi на ранніх стадіях розвитку може спричинити летальність цих трансгенних ліній pVALIUM20.

Щоб перевірити цю ідею, ми вибрали систему Nub-Gal4 tub-Gal80 ts для порівняння фенотипів крил за допомогою pNP і pVALIUM20. Gal80 ts є термочутливим репресором Gal4, під контролем тубулін промоутер 30,31 . Схрещених мух спочатку підтримували при допустимій температурі 18 ℃, що дозволяє Gal80 придушувати діяльність Gal4. Личинки третього віку потім були зміщені до 29 ℃, що інактивує Gal80, тим самим дозволяючи Gal4-залежній експресії відбуватися нормально і виснажувати гени гістонів. Як показано на рис. 4a, ми спостерігали сильно порушений фенотип крила для всіх гістонів, виснажених за допомогою системи pNP, подібно до фенотипів RNAi, керованих MS1096-Gal4 (додаткова рис. 5). На відміну від цього, система pVALIUM20 не показала явного фенотипу для жодного з виснажених гістонів (рис. 4а). Результат qRT-PCR також підтвердив, що система pNP була більш ефективною, ніж система pVALIUM20 (рис. 4b), підтримуючи систему pNP, можна було ефективно модулювати гени високої експресії з низькими хибнопозитивними результатами.

Система pNP могла ефективно модулювати гени високої експресії. а Систему Nub-Gal4 tub-Gal80 ts використовували для умовного знищення гістонів у системах pNP і pVALIUM20, при цьому мух спочатку інкубували при 18 °C, а потім перемістили до 29 °C на третій личинкової стадії. Масштабні смуги, 500 мкм. б Систему act-Gal4 tub-Gal80 ts використовували для qRT-PCR аналізу ефективності RNAi, націлювання H1, H2A, H2B, H3, і H4 (п = 3, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест (*с < 0,05, **с < 0,01, ***с < 0,001)

Хибнопозитивні результати pVALIUM20-H2A, H2B і H4 мухи, ймовірно, були внаслідок комбінації непрохідної експресії та індукованої MS1096-Gal4 RNAi на ранній стадії розвитку. У нашому аналізі pVALIUM20-H2A, H2B і H4 керовані MS1096-Gal4 були смертельними (додаткова рис. 5), але були життєздатними та створювали слабкі фенотипи крил за допомогою Nub-Gal4 tub-Gal80 ts , що запобігало RNAi на ранній стадії розвитку (рис. 4a). Однак ці шпильки, керовані MS1096-Gal4 в більш ефективній системі pNP (також з низькою експресією витоку), були життєздатними (додаткова рис. 5) і давали такі ж серйозні фенотипи, як і створені Nub-Gal4 tub-Gal80 ts (рис. 4a). . Взяті разом, ці результати свідчать про те, що непрозора експресія системи pVALIUM20 плюс індукована MS1096-Gal4 RNAi на ранній стадії розвитку може викликати хибнопозитивні результати.

Ці спостереження показали, що система pVALIUM20 може призвести до летального результату через витікання та неспецифічну експресію, що може бути проблематичним, особливо при застосуванні цієї системи для великомасштабних генетичних екранів. Наприклад, ми випадковим чином вибрали 20 генів, для яких shRNA в pNP давали фенотип дефекту крила, якщо їх схрещувати з Gal4, специфічним для крила, три з них були смертельними, якщо ті самі шпильки використовувалися в pVALIUM20, що ще більше підтверджує високу тканинну специфічність системи pNP (додаткова інформація). Дані 3). Взяті разом, ці результати показують, що система pNP є більш ефективною, ніж система pVALIUM20, у знищенні генів, що представляють інтерес, у тому числі з високим рівнем експресії, і що вона виробляє очікувані сильні фенотипи без явної протікання експресії, яка часто спостерігається в pVALIUM20. системи.

Система pNP може одночасно націлюватися на кілька генів

Білки, що кодуються двома або більше генами в дрозофіла може мати частково перекриваються або надлишкові функції, і, таким чином, виснаження однієї з них може призвести до незначного впливу на функціональний або фенотипічний аналіз або взагалі не мати його. Крім того, виснаження однієї субодиниці білкового комплексу може призвести до утворення часткових білкових комплексів, які можуть мати домінантно-негативні або неоморфні ефекти in vivo. Таким чином, вигідно одночасно виснажувати кілька генів. Однак існуючі трансгенні вектори RNAi можуть приймати лише одну shRNA, тому для одночасної дії на два або більше генів потрібні громіздкі генетичні схрещування. Інша проблема полягає в тому, що генетична рекомбінація може знизити ефективність RNAi через розведення Gal4, а також через те, що часто виникають нездорові рекомбінанти.

Міжгенна лінкерна область між miR-2a-1 і miR-2b-2 була вставлена ​​у вектор pNP після каркаса miR1 (додаткова рис. 1), який міг експресувати декілька shRNA. Ми провели три групи експериментів паралельно, порівнюючи ефективність вичерпання цих наборів цільових генів в одному векторі окремо або одночасно. Спочатку ми субклонували націлювання на шпильку Виїмка націлювання на ген і шпильку білий ген у вектор pNP, позначений як pNP-Н-В вектор та генеровані трансгенні лінії. Ті самі шпильки, субклоновані у вектор pNP окремо, використовували як позитивний контроль. Коли керується специфічною для очей лінією GMR-Gal4, виснаження RNAi білий повністю усуває червоні пігменти в очах, збиваючи при цьому будь-які Виїмка самостійно або Виїмка і білий разом (Виїмка-білий) викликала летальність на стадії личинки (рис. 5а). Якщо RNAi була індукована специфічною для крила лінією C96-Gal4, виснаження білий у крилі не генерували жодних аномальних фенотипів, як очікувалося, тоді як виснаження обох Виїмка самостійно або Вирізка-біла створив той самий фенотип крил зі зменшеним розміром. Спостереження про те, що вплив на око виснажує білий ген і ефекти крила, викликані нокдауном Виїмка відбуваються незалежно в межах pNP-Н-В лінія демонструє, що вектор pNP може одночасно націлюватися на кілька генів з одним вектором RNAi (рис. 5b). Щоб перевірити можливість того, що на індуковані RNAi фенотипи може впливати порядок шпильок у векторі pNP, ми створили трансгенну лінію з білий шпилька перед Виїмка шпилька (pNP-В-Н), а потім порівняв ефективність RNAi з ефективністю pNP-Н-В лінія. Як показано на рис. 5a, b, обидва pNP-В-Н і pNP-Н-В лінії генерували ідентичні фенотипи, коли вони керувалися лініями GMR-Gal4 або C96-Gal4, що свідчить про те, що шпильки у векторі pNP функціонують незалежно, без послідовного ефекту.

Система pNP може одночасно націлюватися на кілька генів. а RNAi проти білий викликали повну втрату червоного пігменту в оці також відзначають, що збивають виїмка в оці використання GMR-Gal4 викликало летальність. Масштабні смуги, 200 мкм. б У порівнянні з контролем, pNP-Н, pNP-W-N і pNP-N-W керований C96-Gal4, всі показали схоже Виїмка фенотипи дефекту крил. Масштабні смуги, 500 мкм. c Порушення Ci під впливом Nub-Gal4 викликало переднє зрощення вен L3 і L4 крила, при цьому збиваючи E2F1 викликаний малим крилом із переднім зрощенням вен L2 і L3. Комбінований фенотип переднього злиття вен L2, L3, L4 та малого крила показаний у pNP-Ci-E2F1 і pNP-E2F1-Ci мухи. Масштабні смуги, 500 мкм. d, e Традиційна генетична комбінація pNP-Ci і pNP-E2F1 виявив набагато слабший фенотип. Лише невелика частка pNP-Ci pNP-E2F1 мухи показали обидва Ci КД і E2F1 KD фенотип більшість з них генерується також Ci КД або E2F1 KD, тоді як були навіть деякі подібні з фенотипом дикого типу. Масштабні смуги, 500 мкм

Крім того, ми обрали інший набір генів, що кодують білок, Ci і E2F1, оскільки виснаження їх обох за допомогою Nub-Gal4 створило різні фенотипи в крилі. Як показано на рис. 5c, виснаження Ci використання pNP-Ci генерується переднє зрощення між L3 і L4 без впливу на розмір крила, збиваючи при цьому E2F1 використання pNP-E2F1 призвело до меншого крила із злиттям вен між L2 і L3. Коли обидва гени були виснажені за допомогою pNP-Ci-E2F1 лінія або pNP-E2F1-Ci лінії, ми спостерігали таке ж крило малого розміру, що і для pNP-E2F1, який також мав злиття вен, один був між L2 і L3 від E2F1 KD, інший був між L3 та L4 від Ci КД (рис. 5в). Ці фенотипи, мабуть, пов’язані з адитивним ефектом тих, що викликаються виснаженням E2F1 або Ci окремо, що додатково підтримує високу ефективність системи pNP у націленні на кілька генів. Знову ж таки, ніякого послідовного ефекту не спостерігали при порівнянні pNP-Ci-E2F1 лінія та pNP-E2F1-Ci лінія (рис. 5в). Щоб порівняти ефективність множинного нокдауну shRNA з системи pNP з традиційною генетичною рекомбінацією, pNP-Ci і pNP-E2F1 спочатку були генетично рекомбіновані, а потім схрещені з лінією Nub-Gal4. Цікаво, що лише 2,47% pNP-Ci pNP-E2F1 мухи показали обидва Ci КД і E2F1 KD фенотипи більшість з них генерували або Ci КД або E2F1 Один лише фенотип KD, тоді як 6,81% фактично не продукували очевидного фенотипу (рис. 5d, e). Цей змінний результат ілюструє ще один недолік використання традиційної генетичної рекомбінації для знищення кількох генів, імовірно, через конкуренцію за зв’язування Gal4 двома касетами UAS. Крім того, мухи з інтегрованою лінією pNP-Ci pNP-E2F1 виявилося слабким, оскільки гомозиготність була летальною до дорослого віку, ймовірно, через занадто багато екзогенних генетичних компонентів. Ці спостереження також підтверджують думку про те, що система pNP є більш надійною та універсальною, ніж традиційна рекомбінація для націлювання на кілька генів.

Для подальшої перевірки здатності pNP виснажувати декілька генів одночасно, ми застосували цю систему до репресивного комплексу 1 Polycomb (PRC1), який функціонує як комплекси репресорів транскрипції, необхідні для нормального розвитку 32 . Одночасний нокдаун чотирьох основних білків PRC1 спричинив серйозні дефекти очей, тоді як виснаження їх окремо не викликало жодних дефектів в оці (додаткова рис. 6a).Ефективність RNAi тетрадичного гена-KD також порівнянна з одногенним KD, перевіреним за допомогою qRT-PCR-аналізу (додаткова рис. 6b). Взяті разом, ці результати демонструють чудову ефективність системи pNP для одночасного знищення кількох генів.

HAT регулюють розвиток очей через сигнальні шляхи Wnt

Намагаючись перевірити цю трансгенну систему RNAi для вивчення білків з частково надлишковими функціями, ми вирішили вивчити сімейство гістоноацетилтрансфераз (HATs), ферментів, які в основному ацетилюють залишки лізину на гістонах. Враховуючи, що сімейство ферментів HAT регулює активацію транскрипції, відновлення ДНК і клітинний цикл, порушення їхньої діяльності часто пов’язують з епігенетичними змінами при багатьох порушеннях розвитку та захворюваннях, таких як рак 33 . Активація транскрипції вимагає кількох HAT, а функції деяких HAT, як правило, є зайвими, тому виснаження одного HAT недостатньо для створення фенотипів. Ми зосередили свій аналіз на наборі HAT, які належали сімействам MYST або GNAT, в тому числі chm, Tip60, і Gcn5. Після генерування трансгенних ліній РНК проти chm, Tip60, Gcn5, і комбінації chm-Tip60 і chm-Tip60-Gcn5, ми перетнули ці лінії з специфічною для очей лінією GMR-Gal4. Ми помітили, що pNP-chm, pNP-Порада60, pNP-Gcn5і pNP-chm-Tip60 не викликало жодних дефектів в оці (рис. 6а). Однак, одночасно виснажуючи всі три HAT в оці за допомогою pNP-chm-Tip60-Gcn5 Лінія призвела до серйозно дефектного фенотипу ока, що характеризується надлишковою продукцією очного пігменту, некротичною загибеллю клітин і дещо зменшеним розміром ока (рис. 6а). явних дефектів не виявлено.

Гістоноацетилтрансферази регулюють розвиток очей через сигнальні шляхи Wnt. а chm, Tip60, Gcn5 одиночний нокдаун або chm-Порада60 подвійний нокдаун демонстрував фенотип дикого типу, керований GMR-Gal4, в той час як одночасний нокдаун chm-Tip60-Gcn5 використання системи pNP викликало серйозні дефекти очей. Масштабні смуги, 200 мкм. б Результати qRT-PCR показують це chm, Tip60, Gcn5 всі вони знижені до порівнянного рівня у мух із нокдауном з одним геном або нокдауном з потрійними генами. (п = 3, середнє ± s.d.). c Сигнальний шлях Wnt був значно підвищеним, що представлено Wg за допомогою аналізу qRT-PCR (п = 3, середнє ± s.d.). Дані оцінюються за допомогою одностороннього студента т-тест. d Результат імунного фарбування показав підвищену регуляцію Wg у GFP-маркованих chm-Tip60-Gcn5 Клони KD. Пунктирні лінії показували позначений GFP клон. У порівнянні з контролем (позначений довгими хвостовими стрілками) сигнали Wg були значно підвищені в chm-Tip60-Gcn5 Клон KD (позначений короткими хвостовими стрілками). Масштабні смуги, 50 мкм. e Активація транскрипції wg виробляє подібний фенотип очей chm-Tip60-Gcn5 КД літає. Нокдаун wg або рука на тлі chm-Tip60-Gcn5 потрійна RNAi чітко врятувала фенотип ока. Масштабні смуги, 200 мкм

Щоб підтвердити, що цей фенотип справді викликаний виснаженням chm, Tip60, і Gcn5, ми провели аналіз qRT-PCR для вимірювання транскриптів цих генів в очних дисках після RNAi, ініційованого GMR-Gal4. Порівняно з контролем, транскрипти з окремих ліній RNAi та потрійної лінії RNAi були значно зменшені (рис. 6b). Примітно, що ефективність виснаження RNAi в потрійній лінії RNAi була порівнянна з такою в окремих лініях RNAi, що додатково демонструє здатність системи pNP одночасно націлюватися на кілька генів. Щоб додатково виключити можливість нецільових ефектів, ми перевиразили chm-T2A-Порада60-T2A-Gcn5 які нечутливі до шпильок за рахунок використання саморозщеплюючого пептиду T2A в chm-Tip60-Gcn5 потрійних мух KD, і фенотип KD був повністю врятований (додаткова рис. 7b), що підтверджує специфічність цього експерименту RNAi. Крім того, ми також створили лінію трансгенної активації, яка націлена на ці три гени одночасно за допомогою системи flySAM, яку ми нещодавно розробили 34 . Як показано на додатковому малюнку 7c, активація цих трьох генів також значно врятувала chm-Tip60-Gcn5 потрійний пухлиноподібний фенотип KD, що додатково підтверджує специфічність цього потрійного результату KD.

Крім того, для перевірки активності ферменту chm, Tip60, Gcn5 щодо ацетилювання гістонів ми провели імунне фарбування, щоб виявити рівень глобального ацетилювання H4 в політенних хромосомах після RNAi, індукованого специфічним для слинних залоз 1824-Gal4. Інтенсивність імунного фарбування проти ацетилювання Н4 в політенних хромосомах з pNP-chm, pNP-Порада60, pNP-Gcn5 лінії був дещо нижчим порівняно з контролем, тоді як рівні ацетилювання Н4 в політенних хромосомах з pNP-chm-Tip60-Gcn5 лінії були майже непомітними (додатковий рис. 8). Взяті разом, ці спостереження демонструють надлишкову роль цих HAT в епігеномі, додатково підтверджуючи здатність системи pNP успішно модулювати кілька генів.

Дослідити молекулярний механізм фенотипу важкого дефекту ока, що виробляється потрійною РНК-і проти chm-Tip60-Gcn5, ми виявили рівень транскрипції генів нижче за кількома основними сигнальними шляхами, такими як сигнальні шляхи JAK-STAT, EGFR, Hippo, JNK, dpp, Notch і Wnt, через їхню роль у регуляції розвитку очей. Зокрема, ми проаналізували вираз SOCS36E, aos, Yki, puc, Папа, Су(Н) і wg як показники активності вищезгаданих сигнальних шляхів в очних дисках, коли ці HAT виснажені 35 . Як показано на рис. 6c, wg, мішень передачі сигналів Wnt, була значно підвищена більш ніж у п'ять разів у порівнянні з контролем, тоді як репрезентативні цільові гени інших перевірених шляхів передачі сигналів не зазнали значного впливу в очних дисках, збіднених HAT. Ці спостереження показують, що Wnt може бути основним сигнальним шляхом, на який впливають ці HAT в очних дисках.

Щоб перевірити вплив виснаження HAT на передачу сигналів Wnt, ми створили chm-Tip60-Gcn5 Клони KD маркували GFP в крилових дисках, а потім аналізували рівні експресії Wg за допомогою імунного фарбування. Як показано на рис. 6d, chm-Tip60-Gcn5 Клони KD показали чітко підвищений рівень білків Wg. Тим часом ми побудували wg транскрипційна активація мух за допомогою системи CRISPRa 34 , яка показала точно такий же фенотип ока, як і chm-Tip60-Gcn5 KD під час керування GMR-Gal4 (рис. 6e). Щоб додатково підтвердити, що дефектний фенотип ока справді був викликаний підвищеною сигналізацією Wg, ми виснажили wg на додаток до потрійного нокдауну з chm, Tip60 і Gcn5. У порівнянні з chm-Tip60-Gcn5-GFP-РНК-контроль, який був таким же, як і chm-Tip60-Gcn5 KD фенотипу ми спостерігали, що збиває wg значно врятував фенотип очей, викликаний виснаженням HAT. Аналогічно, одночасне виснаження трьох HAT і рука, що кодує ключовий компонент сигнального шляху Wg, різко врятував дефектний фенотип ока, викликаний вичерпанням цих HAT (рис. 6e). У сукупності ці аналізи свідчать про це chm, Tip60 і Gcn5 синергетично відіграють важливу роль у регуляції розвитку очей, головним чином за допомогою модуляції сигнального шляху Wnt.


Фенотипічна характеристика трансгенних Міскантус китайський Надмірна експресія рослин арабідопсис Фітохром В

Фітохроми — це димерні пігментні білки з оборотним фотохромізмом між червоними і далекочервоними світлопоглинаючими формами. Вони є фоторецепторами, які регулюють різні аспекти росту і розвитку рослин і використовуються для біотехнологічних застосувань для покращення сільськогосподарських показників сільськогосподарських культур. Міскантус види були запропоновані як одна з найбільш перспективних енергетичних культур. У цій статті арабідопсис фітохром В (PHYB) ген був введений в Міскантус китайський використання Агробактерія-опосередкований метод трансформації, який ми нещодавно розробили, за допомогою гена стійкості до гербіцидів (БАР) як маркер вибору. Після того як передбачувані трансгенні рослини були відібрані за допомогою аналізу стійкості до гербіцидів, геномна інтеграція трансгену була підтверджена геномною ПЛР та Саузерн-блот-аналізом, а експресія трансгену була підтверджена за допомогою Нозерн-блот-аналізу. У порівнянні з нетрансформованими контрольними рослинами, трансгенні рослини надекспресуються PHYB показали фенотипи з підвищеною функцією фітохрому В, що включає підвищений вміст хлорофілу, зниження висоти рослин та затримку цвітіння. Тому ці результати свідчать про це арабідопсис фітохром В функціонує в M. sinensis і надати метод розробки Міскантус сорти з підвищеною сільськогосподарською продуктивністю з використанням фітохромів.

1. Введення

Фітохроми – це фоторецептори, які регулюють різні аспекти росту та розвитку рослин у відповідь на червоні та далеко-червоні світлові сигнали з навколишнього середовища [1, 2]. Вони являють собою димерні хромопептиди, кожен мономер (120–130 кДа) має ковалентно пов’язаний відкритий тетрапірольний хромофор, який називається фітохромобілін через тіоефірне зв’язок із залишком цистеїну [3]. Найважливішою характеристикою фітохромів є їх оборотний фотохромізм: властивість змінювати колір при поглинанні фотона і повертатися до вихідної форми при поглинанні іншого фотона. Фітохроми синтезуються у формі Pr, що поглинає червоне світло (

нм), який може бути фотоперетворений у форму Pfr, що поглинає далеко червоне світло (

нм) при впливі червоного світла. Функціональна активність фітохромів модулюється фотохромним перетворенням між цими двома формами [4, 5]. Як відомо, фототрансформація фітохрому Pr-to-Pfr індукує високорегульовану сигнальну мережу для фотоморфогенезу в рослинах [6–8].

Опосередковані фітохромом фотоморфогенні реакції включають проростання, ріст стебла і листя, розвиток хлоропластів, біосинтез хлорофілів та інших пігментів, уникнення тіні, циркадний ритм і цвітіння [9]. В аспекті біотехнологічних застосувань фітохромів фізіологічний аналіз рослин, що надекспресують трансгени фітохрому, раніше виявив потенціал трансгенних підходів до модифікації архітектури сільськогосподарських рослин [10]. Як приклад, рослини тютюну, що експресують трансген фітохрому А вівса (PHYA) демонструють умовну карликовість близькості, що призводить до покращення індексу врожаю до 20% [11]. В принципі, фітохроми опосередковують реакції уникнення тіні рослин, у яких рослини реагують на далеко-червоне випромінювання, відбите від сусідів, і викликають ріст подовження, щоб запобігти перевищення конкурентів, що ростуть поруч [12]. Якщо індукуються реакції уникнення затінку, перерозподіл ресурсів у ріст подовження може призвести до зниження виробництва листя та органів зберігання зі зниженням урожайності [13]. Таким чином, реакція уникнення тіні може бути шкідливою в сільському господарстві, оскільки обмежує густоту посіву. Тому було припущено, що продуктивність рослин можна підвищити за рахунок зниження сприйняття сусідів (тобто придушення реакцій уникнення тіні) за допомогою маніпуляції сприйняттям фітохромного червоного / далеко-червоного світла [14].

Міскантус види – високі багаторічні кореневищні трави з фотосинтезом С4, які мають тенденцію давати високі врожаї біомаси щорічно в широкому діапазоні кліматів [15, 16]. Таким чином, їх пропонують як одну з найбільш перспективних енергетичних культур для виробництва біомаси [17]. Поки що триплоїдний гібрид Міскантус × гігант між диплоїдним M. sinensis і тетраплоїд M. sacchariflorus в даний час є комерційно вирощуваним видом в роду [18, 19]. Однак цей гібрид є безплідним і не має генетичної варіації, тому необхідним є сорти, що розмножуються насінням, у генетично стабільних і фертильних видів, таких як M. sinensis, було піднято [20].

Генетичне вдосконалення шляхом традиційного розведення використовувалося для покращення ознак багатьох видів, але його успіх був обмежений такими бар’єрами, як статеве розмноження та відносно тривалими періодами часу, необхідними для програм розведення. Зовсім недавно методи генної інженерії за допомогою технологій трансформації рослин були використані для більш ефективного поліпшення багатьох видів, завдяки чому корисні ознаки були введені з більш широкого кола джерел протягом економічно вигідного періоду часу [21]. У випадку Міскантус видів, системи генетичної трансформації були створені зовсім недавно з використанням опосередкованого бомбардуванням частинками і Агробактерія-опосередковані методи [22, 23]. Однак поки що немає повідомлень про трансгенні рослини міскантуса з корисним геном, окрім генів селективних маркерів. Тому генно-інженерні рослини міскантуса потребують подальшого розвитку шляхом введення корисного гена за допомогою встановленого методу трансформації.

Метою цього дослідження було створення трансгенних M. sinensis надмірна експресія рослин арабідопсис ген фітохрому В (PHYB) за допомогою Агробактерія- опосередкований метод генетичної трансформації, який ми нещодавно розробили. Крім того, фенотипи трансгенних рослин досліджували з точки зору функції фітохрому, яка включає вміст хлорофілу, висоту рослини та час цвітіння. У цьому дослідженні ми успішно отримали трансгенну M. sinensis рослини з переносником PHYB а також ген стійкості до гербіцидів (БАР) як маркер вибору і виявили, що надмірна експресія PHYB підвищений вміст хлорофілу, зниження висоти рослин і затримка цвітіння M. sinensis рослини. Тому в даній роботі наводиться метод розробки генної інженерії Міскантус сорти з підвищеною сільськогосподарською продуктивністю з використанням фітохромів.

2. Матеріали та методи

2.1. Приготування рекомбінанту арабідопсис Білки фітохрому В

Хромофорно зібрані голопротеїни арабідопсис фітохром B (phyB) експресували, відновлювали та очищали, як описано раніше [24, 25]. Повна довжина Arabidopsis PHYB ген був субклонований в a Пічія вектор експресії pPIC3.5K (Invitrogen). Споріднена мітка стрептавідину з десятьма амінокислотами з вектора pASK75 (Biometra) була прикріплена до 3′ кінця PHYB ген. Праймери 5′-CTCCCCGGGTACGTAACCATGGTTTCCGGAGTCGGGG-3′ (вперед, Smaя/SnaBI) і 5′-TCGCAGCGCTATATGGCATCATCAGCATCATG-3′ (зворотний, Еко47III) використовували для субклонування. Конструктивний підшипник pPIC3.5K PHYB потім був перетворений у Пічія клітини за допомогою апарату Micropulser Electroporation (Bio-Rad). Рекомбінантні фітохромні білки були експресовані в Пічія системи експресії (Invitrogen) та очищені за допомогою афінної хроматографії на стрептавідині (IBA) згідно з процедурою, описаною виробником. Фікоціанобілін (ПХБ) був отриманий з Spirulina platensis екстракти метанолізом, як описано [25], і використовуються як хромофори для зборки голо-фітохрому. Сирі екстракти готували розбиттям Пічія клітини в рідкому азоті за допомогою гомогенізатора (Nihonseiki Kaisha). Потім зразки фітохрому осаджували шляхом додавання 0,23 г/л сульфату амонію та ресуспендували в буфері (100 мМ Трис, рН 7,8, 1 мМ EDTA), до зразків додавали хромофори ПХБ у ДМСО в кінцевій концентрації 10 μМ, і суміш інкубували протягом в пробірці відновлення на льоду протягом 1 год. Після діалізу для видалення вільних хромофорів зразки завантажували на колонки для афінної хроматографії та очищали білки holo-phyB.

2.2. Zn 2+ Флуоресцентний і спектроскопічний аналіз

Для аналізу флуоресценції Zn 2+ для оцінки хромофорного лігування зразки білка аналізували на 10% гелі SDS-PAGE і гель замочували в 20 мМ ацетату цинку/150 мМ Трис-HCl (рН 7,0) протягом 5–30 хв. кімнатної температури з обережним струшуванням. Цинкову флуоресценцію голофітохромів візуалізували під УФ-світлом (312 нм). Для спектроскопічного аналізу рекомбінантного phyB спектри поглинання реєстрували за допомогою спектрофотометра з діодною матрицею UV/VIS (Cary) після опромінення червоним або далеким червоним світлом. Усі спектроскопічні експерименти проводилися в умовах зеленого безпечного світла, який складався з білої люмінесцентної лампи, оснащеної пластиковим фільтром (Rosco) з максимальним коефіцієнтом пропускання при 500 нм, та волоконно-оптичної системи освітлення (Cole-Parmer), оснащеної В якості джерела світла використовували інтерференційні фільтри 656 і 730 нм (Eriel). Інтенсивність світла становила 8 Вт/м 2 для червоного світла і 6 Вт/м 2 для дальнього червоного світла. Зразки освітлювали червоним протягом 15 хв або далеким червоним світлом протягом 10 хв. Різничний спектр був отриманий шляхом віднімання спектру Pfr від спектру Pr і використаний для визначення міжпікової відстані між максимумами довжини хвилі поглинання Pr і Pfr (

максимумів) і співвідношення піків поглинання Pr і Pfr (APfrПр).

2.3. Плазміда та штам Agrobacterium, що використовуються для генетичної трансформації

Arabidopsis PHYB ген (AT2G18790) був субклонований у бінарний вектор pCAMBIA3301 з БамПРИВІТ/SmaI під контролем промотора убіквітину кукурудзи (Pubi) і Agrobacterium tumefaciens NOS термінатор гена. pCAMBIA3301 несе БАР ген стійкості до гербіцидів як селекційний маркер, і БАР ген кодує фосфінотрицин ацетилтрансферазу, яка надає стійкість до гербіциду фосфінотрицину (PPT). Потім бінарну векторну ДНК використовували для введення в A. tumefaciens штам EHA105 методом заморожування-відтавання [26].

2.4. Генерація імовірних трансгенних M. sinensis Рослини

СНУ-М-045 зародкова плазма насіння с M. sinensis які зберігалися в Сеульському національному університеті, були використані для трансформації, культури тканин і генетичної трансформації M. sinensis були виконані, як описано [23]. Зрілі насіння, отримані ембріогенними каллусами і A. tumefaciens EHA105 містить pCAMBIA3301 з PHYB були використані для генетичної трансформації. Ембріогенні калюси індукували та культивували на середовищі для індукції калюсу (MS солі та вітаміни, 3% сахарози, 3 мг/л 2,4-D, 750 мг/л MgCl2·6H2O, 25 мМ L-пролін, 0,2 г/л гельриту, pH 5,7) протягом 8-10 тижнів. Потім занурювали ембріогенні калюси Агробактерія суспензії та інкубували протягом 15 хв з обережним струшуванням з подальшим видаленням надлишку бактерій та висушуванням на фільтрувальному папері. Потім інфіковані калюси переносили на середовище для спільного культивування (солі та вітаміни MS, 2% сахарози, 1% глюкози, 3 мг/л 2,4-D, 400 μМ ацетосирингон, 3 г/л гельриту, рН 5,7) і інкубували в темряві при 25°С протягом 5 днів.Під час процесу трансформації проводили аналізи фарбування GUS, щоб перевірити, чи були трансформовані ембріогенні калюси. Після трансформації трансгенні калуси відбирали на селекційному середовищі, що містить 5 мг/л PPT, а трансгенні пагони індукували на середовищі регенерації 3 мг/л PPT. Саджанці з добре розвиненим корінням закладали в грунт і вирощували протягом 2 тижнів перед обробкою гербіцидом. Потім проводили аналіз стійкості до гербіцидів шляхом обприскування 0,4% (об/об) BASTA (який містить 18% глюфосінату амонію), а стійкість до гербіцидів імовірних трансгенних рослин визначали через 14 днів.

2.5. Молекулярні аналізи трансгенних M. sinensis Рослини

Геномну ПЛР, Саузерн-блот та Нозерн-блот-аналіз трансгенних рослин проводили, як описано раніше [27, 28]. Для геномного ПЛР-аналізу повну геномну ДНК виділяли з листя рослин, вирощених у теплиці, і кодуючу область для PHYB або БАР трансген ампліфікували за допомогою ПЛР або з геномної ДНК, або з вектора позитивного контролю, використовуючи такі набори олігонуклеотидних праймерів: 5′-TCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAG-3′ (вперед) і 5′-GCAGCGCTCAGTGTCTGCGTTCTCAAAACG (reverse) PHYB, 5′-CTACCATGAGCCCAGAACGACG-3′ (вперед) і 5′-CTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTC-3′ (назад) для БАР. Ген актину (ДІЙ) з M. sinensis також ампліфікували за допомогою тієї ж матриці та праймерів 5′-AACTGGGATGATATGGAGAA-3′ (прямий) і 5′-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3′ (зворотний), а потім запускали як контроль завантаження геномної ДНК. Продукти ПЛР PHYB, БАР, і ДІЙ очікується, що становитиме 1106, 421 та 1046 б.п. відповідно.

Для аналізу Саузерн-блот геномну ДНК розщеплювали будь-яким ХінdIII або ЕкоRI, а гібридизації проводили з БАР генний зонд, позначений [α 32 P] dCTP з використанням Radiprime II Random Prime Labeling System (Amersham Biosciences). Для нозерн-блот-аналізу загальну РНК витягували з листя за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen), а гібридизації проводили з [α 32 P] dCTP-мічений PHYB зонд.

2.6. Вимірювання вмісту хлорофілу

Вміст хлорофілу (chl) вимірювали за допомогою третього листка культиваторів, зібраних у DOY ​​(день року) 273. Листя екстрагували 80% ацетоном і вимірювали поглинання розчину при 645 нм (

). Загальний вміст хлорофілу розраховували за рівнянням: загальний хлорофіл (μг/мл)

. Відносний вміст хлорофілу потім розраховували, встановлюючи вміст хлорофілу нетрансгенної контрольної рослини на 100%.

2.7. Фенотипні аналізи трансгенних M. sinensis Рослини

M. sinensis Рослини в ґрунті вирощували та вегетативно розмножували в культуральній кімнаті (24–26°С з фотоперіодом 16 год). Для дослідження фенотипів рослини потім перенесли та висадили з кімнати для вирощування в ізольовану теплицю ЖІО Сеульського національного університету в Сувоні, Корея (N 37° 16′ 15.08′′, E 126° 59′ 22.02′′). Висоту рослин вимірювали як довжину від землі до верхівки кожної рослини. Дати загону та цвітіння визначали як вихід верхівки волоті з піхви прапорцевого листка та розкриття першої квітки відповідно.

2.8. Статистичний аналіз

Результати фізіологічних параметрів аналізували за допомогою ANOVA з програмним забезпеченням IBM SPSS statistics 20. Достовірна відмінність від контрольного значення(ів) була визначена при

рівень. Усі дані представляли середнє значення ± SD або SE принаймні трьох незалежних експериментів.

3. Результати та обговорення

3.1. Фотохімічні властивості арабідопсис phyB

Існує п’ять ізоформ рослинних фітохромів (phyA–phyE) у моделі дводольних рослин Arabidopsis thaliana, серед яких, як відомо, phyA та phyB відіграють головну роль у рослинах [29, 30]. Наприклад, phyA регулює проростання насіння і ріст розсади у відповідь на далеке червоне світло (FR), тоді як phyB регулює проростання насіння у відповідь на червоне світло (R), ріст рослин і уникнення затінку у відповідь на співвідношення R/FR і цвітіння. час [4]. Зокрема, добре відомо, що phyB-дефіцитний мутант (hy3) показує фенотипи конститутивного уникнення тіні та раннього цвітіння [31], припускаючи, що phyB необхідний для придушення реакцій уникнення тіні та цвітіння у рослин, що необхідно для підвищення продуктивності рослин. Тому ми планували запровадити арабідопсис phyB в M. sinensis та дослідити фенотипи однодольних культур, що надекспресують дводольні phyB.

Перед генетичною трансформацією ми спочатку провели фотохімічний аналіз арабідопсис phyB з використанням очищених рекомбінантних білків, оскільки phyB не був добре охарактеризований через його низьку кількість у рідній тканині [32]. На відміну від цього, спектральні властивості phyA були добре охарактеризовані через відносно високу кількість цього фоторецептора в темних тканинах (

в 100 разів більше, ніж phyB). У цьому дослідженні ми успішно експресували та очищали рекомбінантні білки phyB за допомогою Пічія система експресії білка та афінна хроматографія стрептавідину (Малюнок 1(а)). Очищений арабідопсис phyB показало перев’язування з хромофорним фікоціанобіліном (PCB) і нормальні моделі спектрів поглинання та відмінності (рис. 1). Спектроскопічний аналіз очищених білків phyB показав, що максимуми довжини хвилі поглинання Pr (

) форми 650 нм і 714 нм відповідно. У порівнянні з фотохімічними властивостями phyA вівса в попередній доповіді [25], арабідопсис phyB показав схожі властивості з phyA, включаючи максимуми (64 м) і APfrПр (1.09), отримані з різницевого спектру. Єдина спостережувана відмінність полягала в тому, що довжини хвилі поглинання phyB були злегка зміщені в синій колір (4–6 нм) порівняно з піками поглинання phyA вівса (654 нм для Pr і 720 нм для Pfr). У сукупності результати демонструють, що друкована плата зібрана рекомбінантна арабідопсис phyB має типовий фотохромізм рослинних фітохромів.


(а)
(б)
(а)
(б)

ОБГОВОРЕННЯ

Безліч специфічних фенотипів, індукованих посиленням функції мікроРНК in vivo

Існують численні докази клітинних досліджень, що мікроРНК тварин безпосередньо, але м’яко пригнічують сотні мішеней (Lim et al., 2005 Hendrickson et al., 2009 Guo et al., 2010), навіть якщо їх вимірювати в контексті позаматкової активності. Враховуючи це, наслідки дерегуляції мікроРНК in vivo могли бути обгрунтованими часто невиразними (з огляду на те, що кілька мішеней можуть бути достатньо придушені, щоб виявити фенотипи втрати функції), або часто могли поставити під загрозу загальну життєздатність клітин (з вважають, що зниження координат сотень цілей може призвести до того, що клітини просто стануть нездоровими).

Ми описуємо систематичне дослідження in vivo наслідків цільової неправильної експресії мікроРНК у інтактної тварини. На відміну від вищезгаданих можливостей, ми виявили, що більшість протестованих мікроРНК генерували різноманітні та відносно відмінні мутантні фенотипи, більшість з яких не можна було передбачити з цільових прогнозів або із загальної моделі тонкого налаштування функції мікроРНК. Хоча низка мікроРНК має серйозні несприятливі наслідки, які можуть бути пов’язані з клітинною токсичністю, багато фенотипи, індуковані мікроРНК, дуже нагадують фенотипи, які демонструють мутанти генів у шляхах передачі сигналів/проліферації/апоптозу, які мають вирішальне значення для розвитку тканин і формування паттернів. Ці дослідження розширюють наші попередні функціональні скринінги в культивованих клітинах, які пов’язували miR-315 з активацією шляху Wnt (Silver et al., 2007), і тепер дозволяють проводити різноманітний функціональний скринінг у тварин. Справді, багато мікроРНК неспоріднених послідовностей генерували подібні фенотипи in vivo, що можна було б пояснити, якщо б вони вражали різні вузлові точки в тих же шляхах.

Багато, якщо не більшість, генів містять законсервовані сайти зв’язування для кількох мікроРНК. Але зрозуміло, що проста присутність законсервованих сайтів зв’язування мікроРНК не гарантує чутливості в спрямованих сенсорних аналізах. Тим більше, що наявність споріднених сайтів зв’язування не робить мікроРНК, ймовірно, здатною індукувати відповідний фенотип втрати функції у тварини, навіть якщо вона неправильно виражена (Silver et al., 2007). Навіть при використанні штучних конструкцій shRNA, розроблених для ідеальної комплементарності для максимального ефекту, типово для них викликати лише частковий нокдаун, а іноді й не працювати взагалі. Відома чутливість до дози сигнальних шляхів ядра клітини та генів шаблонування дає генетичне обґрунтування того, чому вони можуть бути особливо схильні до впливу мікроРНК у спосіб, який перетворюється на явні мутантні фенотипи (Hagen and Lai, 2008 Smibert and Lai, 2010). . Такі генетичні зв’язки можуть керувати функціональними дослідженнями та вказувати на ймовірні цільові шляхи, навіть якщо знання про відповідні обчислювально передбачені цілі відсутні.

Крім розуміння основної генетичної схеми комах, наші дослідження підкреслюють, що ектопічні мікроРНК можуть генерувати специфічні фенотипи розвитку, часто в результаті зміни структури тканини, проліферації апоптозу. Це має суттєві наслідки для інтерпретації етіології захворювань та раку. Наприклад, надмірна експресія зростаючої кількості мікроРНК ссавців може спричинити специфічність клітин або метаболічні дефекти, а мікроРНК, такі як мир-21 (Медина та ін., 2010) та мир-17-92 (He et al., 2005) є явними онкогенами. Наша систематична перевірка в дрозофіла настійно припускає, що десятки мікроРНК хребетних можуть викликати відносно специфічні фенотипи у тварини, але вони лише рідко можна передбачити на основі обчислювальних цільових асоціацій.

Генетичний ресурс для скринінгу мікроРНК in vivo

Багато зусиль було присвячено розширенню колекцій умовно активованих трансгенних вставок в дрозофіла (Бренд і Перрімон, 1993 Рорт та ін., 1998). За останні 15 років вони були надзвичайно корисними для виявлення біологічної активності та функції генів, що кодують білок. Тут ми описуємо загальногеномні колекції трансгенів мікроРНК і демонструємо їх колективну різноманітну діяльність під час розвитку крил. Ці колекції включають лінії вставки P і attP, що забезпечує велику гнучкість для їх подальшого скринінгу. Останній дозволяє безпосередньо порівнювати активність різних мікроРНК, тоді як перший у багатьох випадках забезпечує алельний ряд сильних трансгенів. Наявність цих ліній дозволяє проводити широкий спектр скринінгів із використанням специфічних для тканин або клітин драйверів, щоб оцінити наслідки дерегуляції мікроРНК на розвиток, а також роль дорослих у фізіології чи поведінці. Знання їх функціональних можливостей може потім стати основою для вивчення різних мікроРНК в межах їх ендогенних доменів експресії (Aboobaker et al., 2005 Berezikov et al., 2011).

Поки ця робота розглядалася, Коен та його колеги описали менший набір трансгенів UAS-miRNA та їх застосування для пошуку модифікаторів фенотипу щетини регулятора клітинного циклу. мінус (Шуплевський та ін., 2012). Однак, крім обмеженого набору модифікаторів щетини, їхній аналіз перш за все виявив летальність як результат експресії мікроРНК (Szuplewski et al., 2012). Ми виявили, що понад 100 наших трансгенів мікроРНК викликали летальність у широкій експресії да-Гал4. Однак наш детальний аналіз з використанням панелі водіїв крил виявив ріг достатку різних фенотипів, багато з яких фенокопують модуляцію основних сигнальних шляхів і факторів моделювання (рис. 2, 3, 4, 5 і 6). Наші колекції UAS-miRNA доповнюють і значно розширюють свої трансгени, і разом вони становлять вагомий ресурс для аналізу активності мікроРНК in vivo. Багато мікроРНК мають тонкі, якщо не виявлені фенотипи втрати функції (Miska et al., 2007 Alvarez-Saavedra and Horvitz, 2010), але також буває, що багато мутантів мікроРНК виробляють синтетичні фенотипи в поєднанні з іншими генетичними порушеннями (Brenner та ін., 2010). Такі дані, як наші, забезпечують генетичну основу для проведення більш ніж 100 очевидних активностей мікроРНК і багатьох десятків переконливих зв’язків мікроРНК-мішень/шляху, а також можуть містити більш складні дослідження взаємодії з губками мікроРНК (Loya et al., 2009). Справді, ми надаємо доказ принципу того, як посилення функції мікроРНК K box, яке пригнічує передачу сигналів Notch, інформувало сенсибілізовані генетичні аналізи, які виявили ендогенну активність імовірно дуже надлишкового набору ендогенних мікроРНК K box в обмежуванні передачі сигналів Notch під час розвитку крила. Наші обширні аналізи дають переконливі докази корисності цих загальногеномних колекцій умовно активованих трансгенів мікроРНК і припускають, що вони можуть бути добре доповнені подібними колекціями губчастих трансгенів мікроРНК.


Висновки

Технологія CRISPR-cas9 була успішно використана для знищення кількох генів, що кодують білок, у кількох видів рослин. Хоча успішне редагування некодуючих РНК було продемонстровано на тваринах [огляд у Basak and Nithin (2015)], єдина доповідь про редагування некодуючої РНК міститься в томаті (Li et al. 2018). Ми демонструємо успішне редагування генів некодуючої регуляторної РНК TAS4a/b у сорті винограду 101-14, підщепа, що продукує антоціан. Далі ми демонструємо випадкові нецільові ефекти направляючої РНК TAS4b TAS4a локус, що призводить до химерного локусу TAS4a-b, що піддається подіям гомологічної рекомбінації, пов’язаним із нецільовим редагуванням. Тепер можливі майбутні дослідження, щоб перевірити ролі Vvi-MYBA7 і Vvi-TAS4a/b/c у тканинно-специфічній експресії антоціанів та ролі генів у етіології мікробної та вірусної етіології та, можливо, перевагах живлення переносників членистоногих (Zeilinger et al. 2018).


Параметри доступу

Отримайте повний доступ до журналу на 1 рік

Усі ціни є цінами НЕТТО.
ПДВ буде додано пізніше під час оформлення замовлення.
Розрахунок податку буде завершено під час оформлення замовлення.

Отримайте обмежений за часом або повний доступ до статті на ReadCube.

Усі ціни є цінами НЕТТО.


Обговорення

На специфічність CRISPR/Cas9 впливають різні фактори, включаючи особливості нецільових сайтів та ефективні концентрації комплексів Cas9/sgRNA. Визначення специфічності CRISPR/Cas9 також залежить від методів аналізу, упереджених або неупереджених, і in silico алгоритмів прогнозування поза ціль. Ця складність розглядається як заплутаний фактор для аналізів нецільової мутації, а використання різних стандартів для вимірювання та звітування про нецільову активність впливає на точність висновків (Tsai and Joung 2016 Tycko et al. 2016 Wu et al. 2014).

Відомо, що CRISPR/Cas9 значно більш специфічний у клітинах рослин, ніж у клітинах людини (Feng et al. 2014 Peterson et al. 2016 Wolt et al. 2016 Zhang et al. 2014). Два звіти, засновані на секвенуванні всього геному (WGS) або глибокому секвенуванні, надають докази того, що ефективність редагування системи CRISPR/Cas9 дуже специфічна для арабідопсис (Feng et al. 2014 Peterson et al. 2016). В одному з цих звітів глибоке секвенування загалом 178 нецільових сайтів продемонструвало, що висока специфічність CRISPR/Cas9 у арабідопсис і низькі рівні експресії Cas9, викликані промотором UBQ10, були припущені як причина невиявлених позацільових подій (Peterson et al. 2016). Насправді, конкурентне зв’язування 14 варіантів sgRNA з Cas9 безумовно призвело до значно нижчих ефективних концентрацій кожного варіанту комплексу Cas9/sgRNA. Оскільки з 14 sgRNA, дві (CLE18_2 і GLV8_1) не виявили жодних ознак редагування на цілі, 26 нецільових сайтів з цих двох sgRNA можна було виключити зі списку нецільових сайтів. Таким чином, з решти 152 нецільових сайтів з 12 sgRNAs, 83% (126/152) і 17% (26/152) містили 4 і 3 невідповідності відповідно, що вказує на те, що 12 sgRNAs були передбачені як конкретні за in silico аналізу (Peterson et al. 2016). Тому нижчі ефективні концентрації кожного варіанту комплексу Cas9/sgRNA та відносно специфічні sgRNA можуть бути причинами високої специфічності CRISPR/Cas9 у арабідопсис.

В іншому звіті, поглиблений WGS двох рослин T1 (#T1-46 і #T1-55) і однієї рослини T2 (#T2-46), що містить GAI-sgRNA1, не показав жодних ознак нецільових подій у потенційних нецільові сайти, що містять 1–4 невідповідності (Feng et al. 2014). Однак, хоча WGS ідеально підходить для аналізів нецільових мутацій окремих рослин, через його високу вартість недоцільно систематично оцінювати велику кількість рослин і варіантів sgRNA для визначення специфічності Cas9 (Wu et al. 2014). Таким чином, більшість низькочастотних нецільових подій залишаться без уваги (Wu et al. 2014). Хоча приблизно 60 рослин T1, що містять GAI-sgRNA1, були досліджені на предмет нецільових мутацій за допомогою ПЛР з подальшим секвенуванням, велика кількість рослин T2 не досліджували. Оскільки лише одна sgRNA та обмежена кількість рослин з обмежених поколінь були досліджені на предмет нецільових мутацій, дані не можуть виключити можливість низькочастотних нецільових подій, індукованих тією ж sgRNA, та високочастотних нецільових подій, індукованих іншими варіантами sgRNA (Feng et al. 2014).

Виходячи з наведеного вище аналізу результатів у двох звітах, не є ненормальним, що ми спостерігали високочастотні нецільові мутації в арабідопсис у нашому дослідженні (рис. 1, 2), хоча було передбачено, що sgRNA має високу оцінку специфічності (Haeussler et al. 2016, Hsu et al. 2013). Насправді, спостереження в цьому дослідженні також не узгоджувалися з спостереженнями в наших попередніх звітах, де ми припускали, що та сама sgRNA була специфічною (Wang et al. 2015 Xing et al. 2014). Основна причина цієї невідповідності в результатах полягає в тому, що наші попередні висновки ґрунтувалися лише на одній або двох рослинах T1, і що для стимулювання Cas9 використовувалися різні промотори. Відповідно до цього уявлення, в нашій попередній доповіді про sgRNA, спрямовану на ABI1 ген, дослідження восьми Т1 abi1 мутанти та дві популяції T2 для нецільових мутацій дали результати, подібні до тих, що спостерігалися в цьому дослідженні (Zhang et al. 2017b). З 8 Т1 abi1 мутантів, 1 (1/8 або 13%) рослина T1 містила гетерозиготні або химерні нецільові мутації в AT5G02760 з 2 невідповідністю, і всі 8 ліній не містили нецільових мутацій ABI2 лише з 1 невідповідністю, а інші 2 гени з 3 невідповідністю. Аналіз 52 рослин Т2 з лінії Т1, що містять нецільові мутації AT5G02760 показали, що 85% рослин Т2 (44/52) містять нецільові мутації в AT5G02760, а 17% (9/52) мали нецільові мутації ABI2 і обидва гени. Аналіз 41 рослини T2 з іншої лінії T1, яка не містить нецільових мутацій, показав, що 10% рослин T2 (4/41) мали нецільові мутації в AT5G02760, 4,9% (2/41) мали нецільові мутації в ABI2, а 2,4% (1/41) мали нецільові мутації в обох генах (Zhang et al. 2017b). Відповідно до результатів цього дослідження (рис. 2), ці результати свідчать про те, що нецільові ефекти посилюються в наступному поколінні. Було б цікаво використовувати нашу систему CRISPR/Cas9, керовану специфічними промоторами яйцеклітини (EPC), щоб визначити специфічність GAI-sgRNA1, оскільки її оцінка специфічності була 64 по відношенню до діапазону 0–100, що набагато нижче (94). ) sgR-ETC2 (Haeussler et al. 2016, Hsu et al. 2013).

Високочастотні нецільові мутації в CPC ген можна віднести до деяких особливостей послідовності, таких як положення, розподіл та ідентичність невідповідностей (Tsai and Joung 2016 Wu et al. 2014). Хоча нецільовий сайт в CPC ген має три невідповідності з sgRNA-ETC2, перша невідповідність, розташована на першій основі дистальніше PAM, зазвичай переноситься системою CRISPR/Cas9 (рис. 1). Друга невідповідність також знаходиться далеко від PAM і/або дві невідповідності розташовані далеко один від одного, що також може пояснювати високочастотні нецільові мутації в CPC ген, а не СПРОБУЙТЕ ген або AT5G50230 (рис. 1). PAM-проксимальний

11-nt були визначені як початкова область для активності Cas9, і невідповідності в регіоні переносяться гірше (Wu et al. 2014). У деяких інших дослідженнях область насіння була звужена до PAM-проксимальної 5-nt (Wu et al. 2014). Різні концентрації комплексу CRISPR/Cas9 та тривалість зв’язування та розщеплення Cas9 можуть бути відповідальними за спостережувані варіації довжини насіння, виявлені різними аналізами. Тому не дивно для високочастотних нецільових мутацій в CPC позацільовий сайт, що містить невідповідність у 8-му nt у PAM-проксимальному положенні (рис. 1). Подібно до цього дослідження, наше попереднє дослідження за участю sgRNA-ABI1 показало, що нецільові сайти також містять невідповідність у 9-му nt у PAM-проксимальному положенні (Zhang et al. 2017b). На частоту нецільових подій також впливала невідповідність ідентичності, і її можна було значною мірою позначити як: rN:dT ≥ rU:dG >> rC:dC >> rA/rG:dA/dG (Doench et al. 2016 Tsai and Tycko, 2016 та ін. 2016). 8-е та 9-е невідповідності, згадані раніше, були невідповідністю rC:dT, що свідчить про те, що ця ідентичність невідповідності часто допускалася і сприяла нецільовим ефектам у рослин. Спостереження про те, що нецільовий сайт містить два невідповідності з націлюванням sgRNA ABI1 відображення більш високої частоти нецільових ефектів, ніж те, що містить одну невідповідність (Zhang et al. 2017b), вказує на те, що більше факторів слід враховувати при розробці більш точних алгоритмів нецільового прогнозування, які базуються на великих наборах навчальних даних з високопродуктивних експериментів .

Оскільки наша система EPC є відносно короткочасною системою експресії (Wang et al. 2015), здавалося, що вона повинна мати значно нижчу частоту поза цільовою, ніж системи, керовані конститутивними промоторами, включаючи 2 × 35S, UBQ1, UBQ10 і PcUbi4-2 (Fauser et al. 2014 Feng et al. 2014 Peterson et al. 2016). На противагу цьому припущенню, ми спостерігали високочастотні нецільові мутації в CPC гена, що свідчить про те, що в системі EPC висока доза комплексу CRISRP/Cas9 в яйцеклітинах і ембріонах однієї клітинної стадії компенсувала короткий час мутацій, що не є цільовими. Відповідно до цього уявлення, порівняння результатів, отриманих з тРНК-sgRNA(m) і tRNA-sgRNA(o), показало, що збільшення дозування комплексу значно підвищило частоту нецільових мутацій: 66,7 проти 20,0% (рис. S1 ).

Зрозуміло, що tRNA-sgRNA(m) загалом має значно вищу ефективність редагування, ніж tRNA-sgRNA(o) (Xie et al. 2015) і sgRNA(m) (Dang et al. 2015). Однак це дослідження показало, що тРНК-sgRNA(o) мала помітно нижчу ефективність редагування, ніж sgRNA(o), що абсолютно всупереч нашим очікуванням (рис. 3, 4, S1 і S2). Цей висновок можна віднести до трьох аспектів. По-перше, система EPC може бути набагато більш чутливою до коливань ефективних концентрацій або активності комплексу CRISPR/Cas9, ніж системи, керовані конститутивними промоторами. Відповідно до цього уявлення, різні термінатори (Wang et al. 2015) і навіть касета mCherry за термінатором (рис. 3) значно вплинули на ефективність редагування системи EPC. Крім того, високоспецифічні варіанти SpCas9 викликали нижчу ефективність мутацій у рослинах T1, ніж їх аналог дикого типу, що вказує на те, що система EPC була більш чутливою до коливань активності варіантів CRISPR/Cas9. Для конститутивно експресованих систем CRISPR/Cas9 низькі рівні sgRNA, якщо вони існують, з тРНК-sgRNA(o) можуть бути компенсовані подовженою тривалістю експресії або активності комплексу, що призводить до загальної високої ефективності редагування (Xie et al. 2015). По-друге, промотори U6, які ми використовували, можуть бути більш чутливими до 4 × T, потенційного термінатора промоторів Pol-III в оригінальному каркасі sgRNA, ніж промотор OsU3. По-третє, вторинна структура тРНК (структура конюшини), утворена після транскрипції, може посилити термінацію на 4 × T-сайтах. Якою б не була причина, у цьому дослідженні було помічено, що тРНК-sgRNA(m) була оптимальною формою, яка сприяла успішному застосуванню не тільки касети mCherry у зустрічному відборі рослин, вільних від Cas9 (Gao et al. 2016), але й високоспецифічні варіанти Cas9 (Chen et al. 2017 Kleinstiver et al. 2016 Slaymaker et al. 2016), щоб уникнути виникнення нецільових ефектів.

Наші результати також свідчать про те, що високоспецифічні мутантні варіанти SpCas9 вимагають набагато вищих концентрацій для підтримки високої ефективності редагування, ніж аналог дикого типу (рис. 5), хоча ще належить визначити, чи вплинув мутантний каркас sgRNA на їх ефективність редагування. Ці варіанти SpCas9, керовані конститутивними та сильними промоторами в поєднанні зі стратегією злиття тРНК-sgRNA(m), можна використовувати для високоспецифічного та високоефективного редагування геному в сільськогосподарських культурах. Особливо в системах CRISPR/Cas9, опосередкованих гемінівірусом, ефективність редагування високоспецифічного SpCas9 буде значно посилена, оскільки реплікони ДНК, що містять касети Cas9 і sgRNA, тимчасово підсилюють сотні копій у рослинній клітині, що призводить до дуже високих концентрацій CRISPR/ Комплекс Cas9 в клітині (Cermak et al. 2017). Отже, разом із швидкою еволюцією інтегрованих застосувань систем репліконів на основі гемінівірусів та систем CRISPR/Cas9, високоспецифічний SpCas9 буде особливо корисним для уникнення нецільових мутацій, спричинених високими дозуваннями комплексів CRISPR/Cas9 у клітині (Gil -Humanes et al. 2017 Wang et al. 2017).

Одним з наших несподіваних, але цікавих висновків у цій доповіді були високочастотні вставки Т-ДНК в сайти розщеплення (рис. 6, S3–S5). Цей висновок може сприяти розробці експерименту для цілеспрямованої інтеграції трансгенів (Li et al. 2016 Salomon and Puchta 1998 Tzfira et al. 2003) і може викликати додаткові занепокоєння щодо аналізу мутацій. По-перше, при невдачі в ПЛР-ампліфікації цільової області слід розглядати вставки Т-ДНК як можливість. По-друге, у попередніх звітах типи мутацій, які були ідентифіковані як вставки невідомих великих фрагментів, можна було б повторно розглядати як події вставки Т-ДНК. По-третє, для Т1 арабідопсис мутанти, створені за допомогою системи EPC, або мутанти T0, створені з ембріогенного калюсу, співвідношення гомозиготних або біалельних мутантів підлягають завищенню та недооцінці відповідно. Цілеспрямована інтеграція двох копій Т-ДНК у два алелі CPC ген у цьому звіті або HAB1 Ген у попередньому дослідженні може також представляти нові знання про опосередковані Agrobacterium вставки Т-ДНК в геном рослин. По-перше, CRISPR/Cas9-опосередковане розщеплення ДНК може бути завершено до того, як Т-ДНК інтегруються в геном клітин-мішеней. По-друге, для арабідопсис floral dip трансформація (Desfeux et al. 2000), випадкова інтеграція Т-ДНК зазвичай відбувається до запліднення, тоді як CRISPR/Cas9-опосередкована цільова інтеграція Т-ДНК відбувається після запліднення.

Оскільки sgR-ETC2 індукував нецільові мутації в CPC з високою частотою, в СПРОБУЙТЕ із середньою частотою, а в AT5G50230 при низькій частоті при виявленні рівня, наші результати свідчать про те, що ретельно відібрані цільові сайти значною мірою гарантують високу специфічність. Це спостереження було підтверджено нашим попереднім звітом, де ми виявили спричинені sgR-ABI1 нецільові мутації в ABI2 і AT5G02760, але не виявив нецільових мутацій в AT2G25070 і AT3G17090. Передбачувані цільові сайти не повинні мати потенційних нецільових сайтів, які містять менше ніж три невідповідності та легко прийнятні функції невідповідності. Крім того, рекомендується бути усвідомленим при націленні на кілька високогомологічних генів, оскільки сторонні сайти, можливо, сусідять з цільовими сайтами, що може призвести до посилення нецільових ефектів, подібно до випадку, описаного в цьому дослідженні. Загалом, ми рекомендуємо використовувати комбіновані форми наступних шести стратегій, щоб уникнути нецільових ефектів у рослин (Tycko et al. 2016). По-перше, високоспецифічні цілі повинні бути ретельно відібрані з використанням in silico передбачення (Haeussler et al. 2016). По-друге, мутанти, вільні від Cas9, слід ізолювати, наскільки це можливо (Gao et al. 2016 Lu et al. 2017). По-третє, за необхідності можна використовувати високоспецифічні варіанти SpCas9 у поєднанні з методом злиття тРНК-sgRNA(m) (Chen et al. 2017 Kleinstiver et al. 2016 Kulcsar et al. 2017 Slaymaker et al. 2016 Xie et al. 2015 Чжан та ін. 2017a). По-четверте, за необхідності можна використовувати SaCas9 або інші ортологи з більш високою специфічністю (Steinert et al. 2015). По-п’яте, за потреби можна використовувати парні нікази (Fauser et al. 2014). Нарешті, за потреби можна використовувати методи без ДНК (Liang et al. 2017 Svitashev et al. 2016 Woo et al. 2015).

У сукупності це перша доповідь про спостереження високочастотного нецільового мутагенезу, індукованого CRISPR/Cas9 у рослин, наші результати свідчать про те, що в рослинах, що містять компоненти CRISPR/Cas9, постійну увагу слід приділяти нецільовим ефектам, викликаним CRISPR. /Cas9 у нинішньому та наступних поколіннях, і що інструменти, оптимізовані в цьому звіті, будуть корисними для покращення ефективності та специфічності редагування геному в рослинах та інших організмах.


Розробка нової штучної зародкової плазми рису для стійкості до динітроанілінового гербіциду шляхом базового редагування OsTubA2

Хімічні гербіциди, які зазвичай використовуються для знищення бур’янів на полі, отримали широке застосування та змінили спосіб боротьби з бур’янами в сучасному сільському господарстві завдяки своїй ефективності, простоті використання та відносно невисокій вартості. За останні десятиліття було розроблено та комерціалізовано велику кількість трансгенних культур, толерантних до гербіцидів (наприклад, кукурудза, соя, бавовна, рис), змінивши світовий ринок насіння (Шютте та ін., 2017). Однак використання хімічних гербіцидів (тобто інгібіторів ALS, EPSPS, інгібіторів ACCase) також різко зросло, що призвело до появи видів бур’янів, стійких до цих гербіцидів. Таким чином, розробка нових стійких до гербіцидів культур для диверсифікації боротьби з бур’янами має велике значення для уповільнення розвитку стійкості бур’янів до гербіцидів і для підтримки сталого виробництва сільськогосподарських культур у майбутньому. Завдяки передовим базовим технологіям редагування за допомогою CRISPR, які з’явилися останнім часом (Ren та ін., 2019 Ван та ін., 2020 Ян та ін., 2018) важливими генетичними варіаціями, пов’язаними з будь-якою стійкістю до гербіцидів, можна безпосередньо та швидко маніпулювати відповідними базовими редакторами. Повідомлялося, що гени тубуліну надають стійкість до трифлураліну та інших динітроанілінових гербіцидів у ряду сільськогосподарських культур (Chu та ін., 2018 Ліонс-Ебботт та ін., 2010). У порівнянні з іншими основними гербіцидами, частота стійкості до дінітроаніліну у бур’янів досить низька (Heap, 2014). Імовірно, це тому, що мутації в генах тубуліну можуть впливати на полімеризацію мікротрубочок, важливий процес поділу та подовження клітин, і, отже, призвести до загибелі рослин. Таким чином, гени тубуліну є перспективними цільовими генами для створення стійких до гербіцидів зародкових плазм для майбутньої селекції сільськогосподарських культур. У цьому дослідженні ми успішно створили нову штучну зародкову плазму рису з резистентністю до трифлураліну та пендиметаліну без шкоди для фітнесу шляхом точного редагування ендогенного OsTubA2 ген у геномі рису. Теоретично цю важливу рису можна також швидко ввести в інші основні культури за допомогою редакторів аденінових баз, опосередкованих CRIPSR.

Раніше було показано, що мутація Met-268-Thr в α-тубулін ген EiTUA1 корелює зі стійкістю до дінітроаніліну у ряду гусячої трави (Eleusine indica) біотипи (Ямамото та ін., 1998). Білки, що належать до α-тубулін і β-тубулін сімейство висококонсервативних, демонструючи до 88% амінокислотної подібності (Rao та ін., 2016). Тому ми припустили, що введення цієї точкової мутації в геном рису може перетворити звичайний рис у сорт, стійкий до гербіцидів. З цією метою проводиться точне редагування основи гомологічного гена α-тубуліну OsTubA2 (LOC_Os11g14220) проводили з використанням раніше описаного редактора основи аденіну рису rBE14 (Yan та ін., 2018). sgRNA, що відповідає NGG PAM, була розроблена для націлювання на комплементарний ланцюг геномної ДНК OsTubA2 на місці Т1981 (Малюнок 1а). Олігогени були синтезовані, сконструйовані та переведені в бінарний вектор rBE14 за допомогою рекомбінації шлюзу, як описано раніше (Ян та ін., 2018). Потім систему rBE14/sgRNA було введено в сорт рису Kitaake (Oryza sativa spp. японська) через Агробактерія-опосередковане перетворення.

Рослини рису були регенеровані з незалежних калусів і генотиповані безпосередньо за допомогою секвенування за Сенгером цільової області. Із 63 отриманих незалежних ліній рису було ідентифіковано 8 ліній (ефективність 12,7%) з перетворенням A > G, що відбувалося в Т1981, замінивши залишок Met268 на залишок треоніну (Малюнок 1b). Усі вісім мутантних ліній були гетерозиготними і не виявляли випадкових інделів. Потенційні нецілі OsTubA2-були передбачені націлювання на rBE14/sgRNA в геномі рису. У восьми позитивних трансгенних лініях не було виявлено жодних нуклеотидних змін у потенційних нецільових сайтах (Малюнок 1c).

Далі T1 нащадки кожного OsTubA2-відредаговані лінії T0 були генотиповані, щоб визначити лінії, в яких була виділена T-ДНК. ПЛР-ампліфікація за допомогою специфічних праймерів, відповідних до Cas9, sgRNA і Hyg трансгенів. Як показано на малюнку 1d ande, деякі особи T1 не мали трансгенів через генетичну сегрегацію. Крім того, секвенування за Сенгером показало, що деякі рослини (тобто № 2-5, № 2-10 тощо.) були гомозиготними. Враховуючи, що проростання насіння китааке дикого типу є чутливим до обробки гербіцидом динітроаніліном (рис. 1f), додатково було проведено фенотиповий та генотипічний аналіз. Насіння рису популяції Т1 гетерозиготних ліній Т0 № 2 і № 5 пророщували в циліндрах, що містять 6,6 мг/л пендиметаліну, що достатньо для інгібування росту гіпокотилю та коренів рису дикого типу. Усі гомозиготні насіння з мутацією M268T виявили стійкість до обробки пендиметаліном, тоді як проростання насіння дикого типу було призупинено. З іншого боку, гетерозиготні рослини виявляли різні фенотипи стійкості відповідно до росту коренів і гіпокотилей у випробуваних умовах, це, ймовірно, є результатом ефекту дозування мутації M268T (Малюнок 1g і h). Ми також проаналізували стійкість до 4,0 мг/л трифлураліну (іншого типу динітроанілінових гербіцидів), який може пригнічувати ріст коренів та гіпокотилі рису дикого типу. Коли трифлуралін застосовували до нащадків Т1, спостерігалися подібні фенотипи (рис. 1h). Таким чином, мутація M268T OsTubA2 дійсно надає рису стійкість до гербіцидів трифлураліну і пендиметаліну і стабільно успадковується в наступних поколіннях.

Всі OsTubA2-редаговані рослини без трансгенів Т-ДНК вирощували в умовах природного освітлення в теплиці. Рослини морфологічно не відрізнялися від рослин дикого типу (рис. 1i). Крім того, було досліджено масу тисячі зерен і швидкість проростання насіння T2, істотної різниці між рослинами M268T та рослинами дикого типу не виявлено (Малюнок 1j). Разом наші результати вказують на те, що введення мутації Met-268-Thr в OsTubA2 редагування бази не спричиняє зниження росту рису.

Генетичне різноманіття OsTubA2 ген у 4726 повторно секвенованих зразках рису досліджували за допомогою RiceVarMap v2.0 (Zhao та ін., 2015). Дані свідчать, що M268 в OsTubA2 не був об’єктом природного або людського відбору під час одомашнення рису (Малюнок 1k). Таким чином, рослини M268T є новою штучною зародковою плазмою з великим потенціалом для майбутнього покращення рису. Деяка кількість α-тубулін Подальше аналізували гени інших основних господарських культур, зокрема пшениці, кукурудзи, ячменю, сорго, ріпаку, бавовни та сої. Вирівнювання послідовності показало, що послідовність локусу M268 високо консервативна серед різних видів (рис. 1l), відкриваючи можливість того, що опосередкована M268T стійкість до дінітроаніліну може бути швидко введена в інші культури за допомогою точного редагування бази.

Підсумовуючи, наше дослідження показує, що мутація M268T в ендогенних OsTubA2 ген, створений редактором аденінової бази, надає рису стійкість до гербіциду динітроаніліну, не викликаючи витрати на придатність. Будь-які інші сорти рису або товарні культури можуть бути покращені за допомогою цієї стратегії в майбутньому за допомогою стійкості до гербіцидів.


Перегляньте відео: จโนไทป I ฟโนไทป I พนธกรรม (Листопад 2022).